紅曲霉T-DNA突變體庫的構建、生物學特性分析及吉霉素合成基因的克隆.pdf

1、紅曲霉（Monascus）能分泌產生紅曲色素（Monascus pigment）、莫吶可琳類物質(Monacolins)、γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）、麥角固醇、異黃酮、不飽和脂肪酸和豐富的水解酶類等多種有益生物活性物質，被廣泛應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。目前對紅曲霉分子生物學方面的研究比較少。
　　本課題實驗材料為一株從紅曲米中篩選到的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）菌株Mp-41

2、，根據優(yōu)化后的根癌農桿菌介導的高效轉化體系，建立了紫色紅曲霉轉化庫，通過對轉化子的生物學特性進行分析篩選到一批變異較大的轉化子，并對其主要代謝產物-紅曲色素和桔霉素進行初步研究。然后采用基因組PCR分析方法，從它們的基因組中分別擴增到兩條pksCT基因啟動子區(qū)部分序列和終止子區(qū)部分序列片段。主要的研究結果為:
　　1、構建根癌農桿菌介導的菌株Mp-41的突變體庫對影響轉化的各因素進行優(yōu)化，這些因素包括:菌株Mp-41的培養(yǎng)基種類、

3、培養(yǎng)的時間以及孢子液的濃度;根癌農桿菌的濃度;根癌農桿菌與菌株Mp-41共培養(yǎng)時所用膜的類型、溫度及共培養(yǎng)的時間;誘導劑乙酰丁香酮(AS)的濃度。優(yōu)化后所建立的高效轉化體系為:Mp-41菌株在葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)，20 d后收集制備濃度為104個孢子/mL的分生孢子懸浮液，誘導劑AS的濃度為100μmol/L，根癌農桿菌的濃度為OD600=0.7，根癌農桿菌與菌株Mp-41在硝酸纖維素膜(NC膜)上共培養(yǎng)溫度為25℃，最佳共培養(yǎng)

4、時間為3d。根據此優(yōu)化后的體系建立了含有1000多株轉化子的突變體庫。
　　2、轉化子的潮霉素抗性PCR鑒定以及遺傳穩(wěn)定分析在葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)突變庫中的1000多株轉化子，然后隨機挑選60株轉化子在不含潮霉素B的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，連續(xù)6代傳代培養(yǎng)后，再在含200μg/mL潮霉素B的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并將菌株Mp-41同時培養(yǎng)以作對照所用，觀察記錄轉化子的生長情況，然后計算轉化子的穩(wěn)定性。提取轉化子的

5、DNA進行潮霉素抗性鑒定。結果表明，所選轉化子在遺傳上基本穩(wěn)定，并且T-DNA片段均已經整合入紫色紅曲霉轉化子菌株中。
　　3、轉化子菌株生物學特性觀察比較將1000多株紫色紅曲霉轉化子菌株接種到葡萄糖乙醇培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和CYA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)7d，同時接種原始菌株Mp-41作為對照，觀察菌落表觀形態(tài)及顯微形態(tài)。結果表明，與原始菌株Mp-41相比，大部分轉化子沒多大變化，但是少數轉化子在表觀形態(tài)以及顯微形態(tài)方面發(fā)生了較大

6、變異。
　　4、轉化子菌株發(fā)酵產物桔霉素含量變化分析以及色價的檢測從形態(tài)變異較大的轉化子菌株中隨機篩選33株轉化子進行發(fā)酵培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)7d，采用紫外-可見光掃描方法以及薄層層析等方法測定了轉化子的色價并分析了轉化子中桔霉素含量，結果顯示，與原始菌株相比，轉化子菌株的色價以及桔霉素的含量發(fā)生了不同程度的變化。分析轉化子產色素能力發(fā)現，所選轉化子菌株中有17株轉化子菌株在505nm處的色價升高，其中轉化子Mp-41-155液態(tài)發(fā)酵

7、后色價達115.98 U/mL，是Mp-41色價66.37 U/mL的1.75倍，固態(tài)發(fā)酵后色價高達2628.71 U/g，是原始菌株Mp-41色價1664.74 U/g的1.58倍;剩下其余15株轉化子菌株的色價降低，其中轉化子Mp-41-62液態(tài)發(fā)酵后測得的色價只有2.71 U/mL，僅為原始菌株Mp-41的0.04倍，固態(tài)發(fā)酵后色價為556.51U/g，而原始菌株Mp-41色價為1664.74 U/g。此外，部分轉化子在波長300

8、-600nm處的吸收峰也發(fā)生了程度不同的變化，原始菌株Mp-41有兩個吸收峰，大部分轉化子如Mp-41-81、Mp-41-83、Mp-41-84、Mp-41-85、Mp-41-88、Mp-41-89、Mp-41-90、Mp-41-91、Mp-41-92、 Mp-41-150、Mp-41-151、Mp-41-152、Mp-41-153、Mp-41-155、Mp-41-156、Mp-41-157、Mp-41-160、Mp-41-161、Mp

9、-41-162、Mp-41-163、Mp-41-164、Mp-41-165、Mp-41-169均有三個明顯的吸收峰，Mp-41-62和Mp-41-86均只有390-400nm左右的一個吸收峰，其余轉化子菌株有兩個吸收峰。分析各轉化子桔霉素產能發(fā)現，有7株轉化子的桔霉素含量明顯降低，而且Mp-41-62和Mp-41-86兩株菌株中幾乎檢測不出桔霉素，估計是因為這兩株轉化子中桔霉素含量低于TLC方法能夠檢測的最低值0.2μg/g。
　

10、　5、轉化子中生物合成桔霉素基因—pksCT基因的保守性分析研究發(fā)現，紅曲霉的色素的合成與桔霉素代謝調控開始于同一個生物合成途徑，pksCT基因是與紅曲霉桔霉素合成相關的基因，實驗選擇了32株轉化子菌株，運用PCR方法，從它們的基因組中擴增得到啟動子區(qū)部分序列和終止子區(qū)部分序列片段的兩條pksCT基因，大小分別為659 bp和591 bp。將擴增產物測序后，再通過NCBI進行BLAST比對。結果表明，擴增到的序列之間具有高度的同源性，而