兩種遺傳性眼病致病基因的定位與突變研究.pdf

1、目的： 先天性白內(nèi)障為較常見的眼病之一，是兒童失明的主要原因。在先天性白內(nèi)障患者中，8％—25％是遺傳性的。利用我國的遺傳資源優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)新的白內(nèi)障致病基因并揭示其突變規(guī)律和特點(diǎn)，用于指導(dǎo)產(chǎn)前基因診斷和遺傳咨詢，將有效地預(yù)防和杜絕白內(nèi)障患兒出生，提高人口質(zhì)量。對(duì)于遺傳性白內(nèi)障的研究已有悠久的歷史，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，目前遺傳性白內(nèi)障已有39個(gè)基因座被確定，其中19個(gè)遺傳性白內(nèi)障致病基因已被發(fā)現(xiàn)。這19個(gè)致病基因分別是

2、10個(gè)晶狀體蛋白基因(CRYAA、 CRYAB、CRYBA1、 CRYBA4、 CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGC、CRYGD和CRYGS)，4個(gè)膜蛋白基因(縫隙連結(jié)蛋白基因GJA3/GJA8、水通道蛋白基因MIP和內(nèi)源性膜蛋白基因LIM2)，3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因(HSF4、PITX3和MAF)，中間絲樣細(xì)胞骨架蛋白BFSP2和染色質(zhì)修飾蛋白基因CHMP4B。但由于先天性白內(nèi)障種類多，表型又多有交叉，研究較為困難。雖然已經(jīng)

3、確定了多個(gè)致病基因，仍然有很多致病基因尚未發(fā)現(xiàn)。本研究收集了5個(gè)遺傳性白內(nèi)障家系，利用先進(jìn)的分子遺傳學(xué)技術(shù)及人類基因組計(jì)劃的成果，開展了白內(nèi)障致病基因研究。 諾里病(Norrie disease，ND)是罕見的X連鎖隱性遺傳病，以視網(wǎng)膜出血、剝離導(dǎo)致兒童失明為其主要特征。因沒有很好的治療辦法，ND預(yù)后極差。ND致病基因?yàn)槎ㄎ挥谌旧wXp11.3的NDP基因。迄今為止，在NDP基因相關(guān)視網(wǎng)膜病變(ND、X連鎖隱性遺傳的家族性滲出性

4、玻璃體視網(wǎng)膜病變、Coats病和早熟性視網(wǎng)膜病)中，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NDP基因的80種突變。本研究收集了一個(gè)中國人諾里病家系，對(duì)該家系進(jìn)行了致病基因突變的鑒定。 材料和方法： 收集5個(gè)遺傳性白內(nèi)障家系，根據(jù)家族史、臨床癥狀及體征進(jìn)行準(zhǔn)確的臨床診斷，繪制系譜圖。與患者及其家屬簽署知情同意書后，采集家系成員外周血5—10ml，—70℃凍存?zhèn)溆谩?根據(jù)美國國立圖書館數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列，對(duì)染色體22q11.2—12.15區(qū)域

5、內(nèi)的4個(gè)已知白內(nèi)障致病基因(CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和CRYBA4)、染色體16q22.1區(qū)域內(nèi)的1個(gè)已知白內(nèi)障致病基因HSF4、染色體1p36.23—36.21區(qū)域內(nèi)的7個(gè)候選基因(PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD2和PAX6)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增這些基因的全部外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)。PCR產(chǎn)物純化回收后，直接測(cè)序。對(duì)于家系4中發(fā)現(xiàn)的PTCHD2基因可能致病突變，PCR

6、擴(kuò)增家系成員及268個(gè)無關(guān)正常個(gè)體的該基因第20個(gè)外顯子與部分內(nèi)含子，限制性內(nèi)切酶ApalⅠ消化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段；使用高保真DNA聚合酶和位于PTCHD2基因外顯子18及外顯子21的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增患者基因組DNA片段，克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒并構(gòu)建PTCHD2微基因(minigene)，轉(zhuǎn)染COS—7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞后提取總RNA，利用RT-PCR檢測(cè)RNA剪接情況。對(duì)于在家系5中發(fā)現(xiàn)的可能致病突變HSF

7、4基因c．356G>A(p.Arg119His)，設(shè)計(jì)針對(duì)突變的錯(cuò)配引物，采用巢式PCR擴(kuò)增家系成員及100名無關(guān)正常對(duì)照個(gè)體的HSF4基因外顯子3中含有突變點(diǎn)的DNA片段，限制性內(nèi)切酶NsbⅠ消化PCR產(chǎn)物，8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切片段。 收集1個(gè)諾里病家系，根據(jù)家族史、臨床體征及眼科B型超聲波檢查進(jìn)行臨床診斷。采集家系成員外周血標(biāo)本，常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA。設(shè)計(jì)并合成3對(duì)PCR引物，通過PCR擴(kuò)增患者及其母親ND

8、P基因的全部3個(gè)外顯子與外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。針對(duì)可能致病突變，通過PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析和PAGE分析驗(yàn)證對(duì)家系所有13名成員進(jìn)行突變鑒定。確定致病突變后，對(duì)家系中一名懷孕的突變攜帶者，采集其胎兒絨毛、提取胎兒DNA。在NPD基因附近染色體區(qū)域選擇2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增胎兒及其他家系成員微衛(wèi)星片段，通過8％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳及銀染分析PCR等位片段基因型。最終通過單體型分析及限制性內(nèi)切酶分析確定

9、胎兒是否攜帶致病基因，進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。 結(jié)果： 臨床檢查表明5個(gè)遺傳性白內(nèi)障家系的表型包括多形態(tài)性白內(nèi)障，后極性白內(nèi)障及核性白內(nèi)障。調(diào)查確定五個(gè)家系成員共計(jì)212人，其中64人患病(男性患者34人，女性患者30人)?，F(xiàn)存家系成員共計(jì)201人，患者55人(男性患者30人，女性患者25人)。5個(gè)家系均符合常染色體顯性遺傳。 25個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星標(biāo)記兩點(diǎn)連鎖分析結(jié)果表明，家系1和2在全部檢測(cè)位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)連鎖。家系3在微

10、衛(wèi)星標(biāo)記D22S689可獲得最大LOD值2.71(θ=0時(shí))，提示該家系表型可能與染色體22q11.2—12.1區(qū)域連鎖。家系4在微衛(wèi)星標(biāo)記D1S1151可獲得最大LOD值3.36(θ=0時(shí))，提示該家系表型與染色體1p36.2的位點(diǎn)連鎖；通過單倍型分析確定致病基因在微衛(wèi)星標(biāo)記1pTTTC(基因組位置8956145)和1pCAAA(基因組位置16294562)之間7.3Mb的區(qū)域內(nèi)；參考已報(bào)道的致病基因范圍，可以將該位點(diǎn)的致病基因范圍縮

11、短至微衛(wèi)星標(biāo)記D1S228與1PCAAA之間2.4Mb的區(qū)域內(nèi)。家系5在微衛(wèi)星標(biāo)記D16S3085可獲得最大LOD值2.63(θ=0時(shí))，提示該家系致病基因在染色體16q22.1區(qū)域內(nèi)。 針對(duì)各家系致病基因定位范圍內(nèi)的已知或候選基因進(jìn)行突變篩查。在家系3中，未發(fā)現(xiàn)CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和CRYBA4四個(gè)已知致病基因的致病突變。在家系4中，對(duì)PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD

12、2、PAX6七個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PTCHD2基因第20個(gè)內(nèi)含子中第5個(gè)堿基由G變?yōu)門，即INV20+5G>A。其它基因沒有發(fā)現(xiàn)有意義的改變。限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果顯示，家系4所有患病成員都攜帶該變化，家系成員中的正常個(gè)體與268個(gè)無關(guān)個(gè)體均不含該改變?；颊逷TCHD2微基因克隆后，轉(zhuǎn)染HeLa和COS—7細(xì)胞，RT-PCR顯示PTCHD2基因的INV20+5G>A改變不影響RNA的剪接。在家系5中，患者HSF4基因測(cè)序結(jié)果表明該基因

13、第三外顯子發(fā)生c．356G>A，使蛋白上高度保守的119位精氨酸替換成組氨酸。限制性內(nèi)切酶分析顯示該家系中所有患病成員都攜帶這個(gè)突變，100個(gè)無關(guān)正常個(gè)體均不含有該突變。 諾里病家系成員現(xiàn)存13名，患者1名(先證者)。疾病傳遞符合X連鎖隱性遺傳。先證者及其母親的NDP基因測(cè)序結(jié)果顯示二人都攜帶NDP基因突變c．220C>T(p.Arg74Cys)，且先證者為該突變的半合子，其母為該突變的雜合攜帶者。酶切鑒定表明家系中另外4名表型

14、正常的女性個(gè)體(Ⅲ3、Ⅳ3、Ⅲ5和Ⅱ5)均為該突變的攜帶者。微衛(wèi)星標(biāo)記單體型分析及限制性內(nèi)切酶分析顯示胎兒為女性，且為致病突變攜帶者。 結(jié)論： 1、本文收集到常染色體顯性遺傳的白內(nèi)障家系5個(gè)。其白內(nèi)障表型不僅在不同家系間有不同，同一家系的不同個(gè)體間也有不同，表明國人中常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障存在表型異質(zhì)性。同時(shí)，不同基因與遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)，表明了遺傳性白內(nèi)障的遺傳異質(zhì)性。 2、在家系1與家系2中，通過連鎖分

15、析排除了全部19個(gè)已知遺傳性白內(nèi)障致病基因的15位點(diǎn)及其它10個(gè)位點(diǎn)，提示存在未知白內(nèi)障致病位點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究。 3、家系3的兩點(diǎn)連鎖分析結(jié)果提示其致病基因可能定位在染色體22q11.2—12.1區(qū)域內(nèi)，但在4個(gè)已知致病基因內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)致病突變，提示可能存在未知突變機(jī)制(包括存在其它位點(diǎn))。 4、家系4的致病基因定位于染色體1p36區(qū)域，參考已報(bào)道的致病基因范圍，將致病基因所在的范圍縮短至微衛(wèi)星標(biāo)記D1S228與1pCA

16、AA之間2.4Mb的區(qū)域內(nèi)；對(duì)該區(qū)域內(nèi)PTCHD2、KAZRIN、CASP9、SPEN、RSC1A1、PRMD2和PAX6七個(gè)可能候選基因測(cè)序尚未發(fā)現(xiàn)致病突變。 5、在家系5中，HSF4基因發(fā)生的c．359G>A(p.Arg119His)突變是該家系的致病突變，此突變是HSF4基因上新的致病突變。再次證實(shí)了HSF4基因與遺傳性白內(nèi)障的相關(guān)性。 6、首次在中國人諾里病家系中發(fā)現(xiàn)了NDP基因錯(cuò)義突變c．220C>T，該突變與