二甲雙胍抑制子宮腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長的機(jī)制研究.pdf

1、子宮腺肌病是普通婦科領(lǐng)域的常見良性疾病，不會(huì)導(dǎo)致患者死亡，但是該病發(fā)病率高，所引起的一系列不適，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。在婦科門診中，子宮腺肌病是導(dǎo)致月經(jīng)過多，痛經(jīng)和性交痛的最常見原因之一，也是引起不孕不育的常見原因，目前除手術(shù)外仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase，AMPK)是目前研究較多的，在細(xì)胞內(nèi)與能量代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的

2、蛋白激酶。由α，β，γ三種亞單位構(gòu)成。其中α-亞單位為催化單位，β-亞單位和γ-亞單位為兩個(gè)調(diào)節(jié)單位。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)急刺激，導(dǎo)致ATP生成減少或消耗增加，AMP/ATP比值升高時(shí)，AMPK將被激活?；罨蟮腁MPK，通過糖原合成的增加（例如糖攝取的增加，糖酵解和脂肪酸氧化等），并抑制消耗糖原的相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)（如脂肪酸，膽固醇和蛋白質(zhì)的合成等），從而增加細(xì)胞內(nèi)的ATP水平。
　　磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(phosphatidylinos

3、itol-3-ki-nase，PI3K)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt又稱PKB(protein kinase B)在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K是細(xì)胞生命活動(dòng)中重要的調(diào)節(jié)分子，Akt是該通路的中心環(huán)節(jié)，其功能涉及血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡的啟動(dòng)、細(xì)胞侵襲性和端粒酶活性等諸多方面。以往諸多探究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與婦科疾病的發(fā)生、發(fā)展、浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為婦科腫瘤的機(jī)制研究以及治療方案提供了新的思路。通過對(duì)PI

4、3K/Akt信號(hào)通路的不斷深入研究，婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制也越來越清晰。但是目前就普通婦科良性疾病如子宮肌瘤、子宮腺肌病等的發(fā)病機(jī)制研究以及是否有PI3K/AKT通路參與有待進(jìn)一步探討。
　　已有研究證實(shí)，AMPK信通路號(hào)與PI3K通路之間存在密切的聯(lián)系。在PI3K異常活化相關(guān)的疾病中，例如癌癥，AMPK已經(jīng)成為一個(gè)新的潛在的治療靶點(diǎn)。然而，迄今為止，還沒有研究對(duì)AMPK在子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行研究探討。
　　二甲

5、雙胍是AMP-活化蛋白激酶激活劑，廣泛用于治療2型糖尿病。最近，二甲雙胍已成為治療女性多囊卵巢綜合征(PCOS)的代表性藥物。二甲雙胍已經(jīng)被證實(shí)能改善多囊卵巢綜合征患者的生育異常，恢復(fù)排卵，提高生育能力。盡管二甲雙胍的治療能使多囊卵巢綜合征患者獲益，然而其對(duì)子宮內(nèi)膜的作用還有待探索。
　　鑒于AMPK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系，我們推測二甲雙胍可能是一個(gè)新AKT通路抑制劑。因此，為了更好地了解二甲雙胍在婦科領(lǐng)域的治療

6、潛力，我們研究的目標(biāo)是在體外評(píng)估二甲雙胍對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，并初步探討該作用的可能機(jī)制。
　　第一部分、AMPK蛋白在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)研究
　　目的：
　　1、檢測AMPK在正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(N-ESCs)及腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(A-ESCs)中是否表達(dá)及表達(dá)差異。
　　2、檢測AMPK特異性阻斷劑Compound C對(duì)N-ESCs、A-ESCs中AMPK的表達(dá)的影響。
　　3、

7、探討Compound C用于阻斷AMPK通路的條件。
　　研究方法：
　　1、收集無菌狀態(tài)的正常子宮內(nèi)膜及腺肌病在位子宮內(nèi)膜標(biāo)本，消化分離獲得間質(zhì)細(xì)胞。
　　2、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法(IHC)檢測N-ESCs、A-ESCs中AMPK的表達(dá)。
　　3、應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法，檢測AMPK在N-ESCs、A-ESCs中的表達(dá)差異。
　　4、將AMPK特異性阻斷劑Compound C分

8、別作用于N-ESCs和A-ESCs，采用WesternBlot方法檢測磷酸化AMPK(p-AMPK)表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1、AMPK在所檢測正常子宮內(nèi)膜及腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。計(jì)算兩組細(xì)胞評(píng)分，A-ESCs組30張切片評(píng)分值為3.4±0.1，N-ESCs組17張切片評(píng)分為2.2±0.2。腺肌病組約為正常組1.5倍(p＜0.05)。
　　2、Western Blot分析結(jié)果表明A-ESCs中AMP

9、K蛋白的相對(duì)表達(dá)量(AMPK/β-actin)為83.4％±13.8％，高于N-ESCs中相對(duì)表達(dá)量58.9％±9.8％。腺肌病組的AMPK相對(duì)表達(dá)量是正常組的1.4倍(p＜0.001)。
　　3、應(yīng)用Compound C作用1h后檢測各組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK，在A-ESCs、N-ESCs中的平均抑制效應(yīng)分別為2.4±0.5倍和2.9±0.9倍。在A-ESCs、N-ESCs中應(yīng)用Compound C1h和24h的平均抑制效

10、應(yīng)均無差別(p＞0.5)。
　　結(jié)論：
　　AMPK在正常子宮內(nèi)膜及腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且在腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(A-ESCs)中表達(dá)強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(N-ESCs)中表達(dá);將AMPK特異性阻斷劑Compound C分別作用于N-ESCs和A-ESCs后，檢測到的磷酸化AMPK(p-AMPK)表達(dá)降低，表明Compound C阻斷AMPK通路。
　　第二部分、二甲雙胍調(diào)節(jié)子宮腺肌病在位子

11、宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長的作用及其機(jī)制研究
　　研究目的：
　　1、檢測二甲雙胍對(duì)正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(N-ESCs)及腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(A-ESCs)生長增殖的作用。
　　2、探討二甲雙胍對(duì)A-ESCs生長增殖作用隨月經(jīng)周期變化的規(guī)律。
　　3、體外實(shí)驗(yàn)探討二甲雙胍對(duì)A-ESCs生長增殖作用的可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、收集無菌狀態(tài)的正常子宮內(nèi)膜及腺肌病在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，MTT法檢測

12、二甲雙胍對(duì)其生長增殖的作用。
　　2、應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法檢測二甲雙胍作用于A-ESCs對(duì)AMPK表達(dá)的影響。
　　3、應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法和MTT法，檢測二甲雙胍對(duì)處于不同月經(jīng)期的A-ESCs的作用，并進(jìn)一步探討該作用之間是否存在差異。
　　4、應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法探討AMPK與Akt通路的關(guān)聯(lián)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　

13、　1.二甲雙胍可以抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長，抑制作用呈濃度依賴性.N-ESCs:IC507.87 mmol/L; A-ESCs: IC502.45 mmol/L。
　　2.二甲雙胍作用后A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加了2.0±0.3倍，Compound C可以阻斷二甲雙胍的作用。各實(shí)驗(yàn)組的磷酸化AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量即AMPK活化率分別為:空白對(duì)照組43.9％±1.6％，二甲雙胍組83.2％±6.1％，Compo

14、und C組23.2％±5.2％，Compound C+二甲雙胍組25.1％±4.1％。
　　3.應(yīng)用雌激素干預(yù)后增生期A-ESCspAMPK/AMPK減少2.1±0.8倍，分泌期減少2.5±0.5倍。
　　4.二甲雙胍作用下，增生期A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量為60.2±2.5（1.6倍于對(duì)照組），分泌期A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量為86.8±4.8(2.3倍于對(duì)照組)5.二甲雙胍作用于增生期A

15、-ESCs以及分泌期A-ESCs后檢測磷酸化（活化）AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別減少2.3倍和3.2倍，該抑制作用與AMPK通路相關(guān)，Compound C阻斷AMPK通路后，該抑制作用消失。
　　結(jié)論：
　　二甲雙胍對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長呈濃度依賴性抑制作用。二甲雙胍通過活化AMPK通路抑制Akt通路達(dá)到抑制子宮腺肌病在位子宮內(nèi)膜增長的作用，該抑制作用在增生期和分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中均有表現(xiàn)，但在分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中抑