二甲雙胍抑制子宮腺肌病在位內膜間質細胞生長的機制研究.pdf

1、子宮腺肌病是普通婦科領域的常見良性疾病，不會導致患者死亡，但是該病發(fā)病率高，所引起的一系列不適，嚴重影響了患者的生存質量。在婦科門診中，子宮腺肌病是導致月經(jīng)過多，痛經(jīng)和性交痛的最常見原因之一，也是引起不孕不育的常見原因，目前除手術外仍未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase，AMPK)是目前研究較多的，在細胞內與能量代謝調節(jié)相關的

2、蛋白激酶。由α，β，γ三種亞單位構成。其中α-亞單位為催化單位，β-亞單位和γ-亞單位為兩個調節(jié)單位。當細胞受到應急刺激，導致ATP生成減少或消耗增加，AMP/ATP比值升高時，AMPK將被激活。活化后的AMPK，通過糖原合成的增加（例如糖攝取的增加，糖酵解和脂肪酸氧化等），并抑制消耗糖原的相關細胞活動（如脂肪酸，膽固醇和蛋白質的合成等），從而增加細胞內的ATP水平。
　　磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(phosphatidylinos

3、itol-3-ki-nase，PI3K)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt又稱PKB(protein kinase B)在細胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K是細胞生命活動中重要的調節(jié)分子，Akt是該通路的中心環(huán)節(jié)，其功能涉及血管生成、細胞周期調控、凋亡的啟動、細胞侵襲性和端粒酶活性等諸多方面。以往諸多探究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路的激活與婦科疾病的發(fā)生、發(fā)展、浸潤與轉移密切相關，為婦科腫瘤的機制研究以及治療方案提供了新的思路。通過對PI

4、3K/Akt信號通路的不斷深入研究，婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制也越來越清晰。但是目前就普通婦科良性疾病如子宮肌瘤、子宮腺肌病等的發(fā)病機制研究以及是否有PI3K/AKT通路參與有待進一步探討。
　　已有研究證實，AMPK信通路號與PI3K通路之間存在密切的聯(lián)系。在PI3K異?；罨嚓P的疾病中，例如癌癥，AMPK已經(jīng)成為一個新的潛在的治療靶點。然而，迄今為止，還沒有研究對AMPK在子宮腺肌病的發(fā)病機制中的作用進行研究探討。
　　二甲

5、雙胍是AMP-活化蛋白激酶激活劑，廣泛用于治療2型糖尿病。最近，二甲雙胍已成為治療女性多囊卵巢綜合征(PCOS)的代表性藥物。二甲雙胍已經(jīng)被證實能改善多囊卵巢綜合征患者的生育異常，恢復排卵，提高生育能力。盡管二甲雙胍的治療能使多囊卵巢綜合征患者獲益，然而其對子宮內膜的作用還有待探索。
　　鑒于AMPK和PI3K/AKT信號轉導通路之間的關系，我們推測二甲雙胍可能是一個新AKT通路抑制劑。因此，為了更好地了解二甲雙胍在婦科領域的治療

6、潛力，我們研究的目標是在體外評估二甲雙胍對子宮內膜間質細胞增殖的影響，并初步探討該作用的可能機制。
　　第一部分、AMPK蛋白在子宮內膜間質細胞中的表達研究
　　目的：
　　1、檢測AMPK在正常子宮內膜間質細胞(N-ESCs)及腺肌病在位子宮內膜間質細胞(A-ESCs)中是否表達及表達差異。
　　2、檢測AMPK特異性阻斷劑Compound C對N-ESCs、A-ESCs中AMPK的表達的影響。
　　3、

7、探討Compound C用于阻斷AMPK通路的條件。
　　研究方法：
　　1、收集無菌狀態(tài)的正常子宮內膜及腺肌病在位子宮內膜標本，消化分離獲得間質細胞。
　　2、應用免疫細胞化學方法(IHC)檢測N-ESCs、A-ESCs中AMPK的表達。
　　3、應用蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法，檢測AMPK在N-ESCs、A-ESCs中的表達差異。
　　4、將AMPK特異性阻斷劑Compound C分

8、別作用于N-ESCs和A-ESCs，采用WesternBlot方法檢測磷酸化AMPK(p-AMPK)表達差異。
　　結果：
　　1、AMPK在所檢測正常子宮內膜及腺肌病在位子宮內膜間質細胞中均有表達。計算兩組細胞評分，A-ESCs組30張切片評分值為3.4±0.1，N-ESCs組17張切片評分為2.2±0.2。腺肌病組約為正常組1.5倍(p＜0.05)。
　　2、Western Blot分析結果表明A-ESCs中AMP

9、K蛋白的相對表達量(AMPK/β-actin)為83.4％±13.8％，高于N-ESCs中相對表達量58.9％±9.8％。腺肌病組的AMPK相對表達量是正常組的1.4倍(p＜0.001)。
　　3、應用Compound C作用1h后檢測各組細胞中p-AMPK/AMPK，在A-ESCs、N-ESCs中的平均抑制效應分別為2.4±0.5倍和2.9±0.9倍。在A-ESCs、N-ESCs中應用Compound C1h和24h的平均抑制效

10、應均無差別(p＞0.5)。
　　結論：
　　AMPK在正常子宮內膜及腺肌病在位子宮內膜間質細胞中均有表達，且在腺肌病在位子宮內膜間質細胞(A-ESCs)中表達強于正常子宮內膜間質細胞(N-ESCs)中表達;將AMPK特異性阻斷劑Compound C分別作用于N-ESCs和A-ESCs后，檢測到的磷酸化AMPK(p-AMPK)表達降低，表明Compound C阻斷AMPK通路。
　　第二部分、二甲雙胍調節(jié)子宮腺肌病在位子

11、宮內膜基質細胞生長的作用及其機制研究
　　研究目的：
　　1、檢測二甲雙胍對正常子宮內膜間質細胞(N-ESCs)及腺肌病在位子宮內膜間質細胞(A-ESCs)生長增殖的作用。
　　2、探討二甲雙胍對A-ESCs生長增殖作用隨月經(jīng)周期變化的規(guī)律。
　　3、體外實驗探討二甲雙胍對A-ESCs生長增殖作用的可能機制。
　　研究方法：
　　1、收集無菌狀態(tài)的正常子宮內膜及腺肌病在位子宮內膜間質細胞，MTT法檢測

12、二甲雙胍對其生長增殖的作用。
　　2、應用蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法檢測二甲雙胍作用于A-ESCs對AMPK表達的影響。
　　3、應用蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法和MTT法，檢測二甲雙胍對處于不同月經(jīng)期的A-ESCs的作用，并進一步探討該作用之間是否存在差異。
　　4、應用蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法探討AMPK與Akt通路的關聯(lián)關系。
　　結果：
　

13、　1.二甲雙胍可以抑制子宮內膜間質細胞的生長，抑制作用呈濃度依賴性.N-ESCs:IC507.87 mmol/L; A-ESCs: IC502.45 mmol/L。
　　2.二甲雙胍作用后A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對表達量增加了2.0±0.3倍，Compound C可以阻斷二甲雙胍的作用。各實驗組的磷酸化AMPK蛋白相對表達量即AMPK活化率分別為:空白對照組43.9％±1.6％，二甲雙胍組83.2％±6.1％，Compo

14、und C組23.2％±5.2％，Compound C+二甲雙胍組25.1％±4.1％。
　　3.應用雌激素干預后增生期A-ESCspAMPK/AMPK減少2.1±0.8倍，分泌期減少2.5±0.5倍。
　　4.二甲雙胍作用下，增生期A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對表達量為60.2±2.5（1.6倍于對照組），分泌期A-ESCs中活化AMPK蛋白的相對表達量為86.8±4.8(2.3倍于對照組)5.二甲雙胍作用于增生期A

15、-ESCs以及分泌期A-ESCs后檢測磷酸化（活化）AKT蛋白的相對表達量分別減少2.3倍和3.2倍，該抑制作用與AMPK通路相關，Compound C阻斷AMPK通路后，該抑制作用消失。
　　結論：
　　二甲雙胍對子宮內膜間質細胞的生長呈濃度依賴性抑制作用。二甲雙胍通過活化AMPK通路抑制Akt通路達到抑制子宮腺肌病在位子宮內膜增長的作用，該抑制作用在增生期和分泌期子宮內膜間質細胞中均有表現(xiàn)，但在分泌期子宮內膜間質細胞中抑