PCR技術(shù)檢測嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點，坂崎腸桿菌是自1961年發(fā)現(xiàn)以來一直受全世界的關(guān)注的一種食源性致病菌，能在嬰幼兒中引起膿血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎特別是對新生兒或免疫力較低的嬰兒，常會導(dǎo)致嚴重的后遺癥甚至死亡。 本文對嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的PCR檢測方法進行了研究。 本試驗以坂崎腸桿菌23S rDNA的保守序列，通過NCBI對比，根據(jù)其特異區(qū)片斷設(shè)計引物。實驗過程中對PCR反應(yīng)體系中鎂離

2、子濃度、模板量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等PCR影響要素進行優(yōu)化，確定了適宜的PCR反應(yīng)體系和擴增程序，其反應(yīng)體系為：2.5uL 10×PCR buffer(10 mmol/L Tris-HC1[pH 8.3]，50 mmol/L KC1，0.1 ％[wt/vol]gelatin,0.5％Tween 20)，3.0uL25 mmol/LMg<2+>，2.0uLdNTPs混合物，0.5uL 10 uM正向引物，0.5uL 10 uM反向引物，0.

3、25uL，(5U uL<'-1>)Taq酶，模板為FTA膜，水16.25uL，總反應(yīng)體系25uL；PCR擴增程序為：PCR反應(yīng)采用冷啟動，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55.6℃退火45 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)，72℃終延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD-18T質(zhì)粒上進行了DNA測序，PCR擴增產(chǎn)物DNA序列與靶基因序列的同源性達100

4、％，從而證實PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物。采用PCR方法共檢測了5株坂崎腸桿菌標(biāo)準株和1株野生株及19株其它革蘭氏陽性菌和陰性菌，結(jié)果表明6株坂崎腸桿菌為陽性結(jié)果，其它菌株均為陰性結(jié)果，因此本研究選擇的引物特異性強且PCR方法的靈敏度為10<'-9>。 采用了七種坂崎腸桿菌基因組DNA提取方法，通過的比較，找出了一種最簡便、最有力的提取方法。對該七種基因組DNA方法的檢出限、操作過程和增菌時間等多方面進行了比較，確定最低檢出限

5、，依據(jù)每種方法檢出限的不同，再次對嬰兒配方奶粉進行污染，找出了每種方法的檢測時間底線，避免了以往過夜培養(yǎng)造成的不必要的時間浪費。結(jié)果顯示出利用FTA濾膜裂解坂崎腸桿菌細胞提取菌體DNA優(yōu)于其它六種方法DNA提取方法，整個實驗過程只需8 h就能完成，比傳統(tǒng)增菌時間縮短了12～22 h。 目前，坂崎腸桿菌的檢測還未有國標(biāo)方法，本實驗與傳統(tǒng)的FDA BAM方法、DFI方法、OK方法進行對比，并通過與VITEK自動生化鑒定系統(tǒng)為鑒定結(jié)果

6、進行陽性對照，本試驗共檢驗了35份樣品其試驗結(jié)果為：PCR方法檢出率為14.3％，敏感性為80.0％，特異性為96.7％，符合率為94.3％，F(xiàn)FA膜方法檢出時間為8 h，試劑盒法、普通熱裂解法檢出時間為11～12 h，溶劑熱裂解法、溶菌酶解法、普通試劑法、蛋白酶K法檢出時間為12～13 h；FDA BAM方法檢出率為11.4％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時間為7 d：DFI方法檢出率為11.4％，敏

7、感性為80％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時間為5 d；OK方法檢出率為17.1％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為91.4％，檢出時間為5 d。四種方法的敏感性相同，PCR方法的特異性略低于BAM方法和DFI方法，但高于OK方法，PCR方法的符合率稍低于BAM方法和DFI方法但高于OK方法，比較之PCR方法檢測時間比其他三種方法大大縮短?？傊肍TA濾膜，采用PCR技術(shù)可只需增菌2 h檢測到嬰兒配方奶粉