PCR技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，坂崎腸桿菌是自1961年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直受全世界的關(guān)注的一種食源性致病菌，能在嬰幼兒中引起膿血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎特別是對(duì)新生兒或免疫力較低的嬰兒，常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥甚至死亡。 本文對(duì)嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。 本試驗(yàn)以坂崎腸桿菌23S rDNA的保守序列，通過(guò)NCBI對(duì)比，根據(jù)其特異區(qū)片斷設(shè)計(jì)引物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)PCR反應(yīng)體系中鎂離

2、子濃度、模板量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等PCR影響要素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，其反應(yīng)體系為：2.5uL 10×PCR buffer(10 mmol/L Tris-HC1[pH 8.3]，50 mmol/L KC1，0.1 ％[wt/vol]gelatin,0.5％Tween 20)，3.0uL25 mmol/LMg<2+>，2.0uLdNTPs混合物，0.5uL 10 uM正向引物，0.5uL 10 uM反向引物，0.

3、25uL，(5U uL<'-1>)Taq酶，模板為FTA膜，水16.25uL，總反應(yīng)體系25uL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55.6℃退火45 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T質(zhì)粒上進(jìn)行了DNA測(cè)序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列與靶基因序列的同源性達(dá)100

4、％，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。采用PCR方法共檢測(cè)了5株坂崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和1株野生株及19株其它革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌，結(jié)果表明6株坂崎腸桿菌為陽(yáng)性結(jié)果，其它菌株均為陰性結(jié)果，因此本研究選擇的引物特異性強(qiáng)且PCR方法的靈敏度為10<'-9>。 采用了七種坂崎腸桿菌基因組DNA提取方法，通過(guò)的比較，找出了一種最簡(jiǎn)便、最有力的提取方法。對(duì)該七種基因組DNA方法的檢出限、操作過(guò)程和增菌時(shí)間等多方面進(jìn)行了比較，確定最低檢出限

5、，依據(jù)每種方法檢出限的不同，再次對(duì)嬰兒配方奶粉進(jìn)行污染，找出了每種方法的檢測(cè)時(shí)間底線，避免了以往過(guò)夜培養(yǎng)造成的不必要的時(shí)間浪費(fèi)。結(jié)果顯示出利用FTA濾膜裂解坂崎腸桿菌細(xì)胞提取菌體DNA優(yōu)于其它六種方法DNA提取方法，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程只需8 h就能完成，比傳統(tǒng)增菌時(shí)間縮短了12～22 h。 目前，坂崎腸桿菌的檢測(cè)還未有國(guó)標(biāo)方法，本實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)的FDA BAM方法、DFI方法、OK方法進(jìn)行對(duì)比，并通過(guò)與VITEK自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)為鑒定結(jié)果

6、進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，本試驗(yàn)共檢驗(yàn)了35份樣品其試驗(yàn)結(jié)果為：PCR方法檢出率為14.3％，敏感性為80.0％，特異性為96.7％，符合率為94.3％，F(xiàn)FA膜方法檢出時(shí)間為8 h，試劑盒法、普通熱裂解法檢出時(shí)間為11～12 h，溶劑熱裂解法、溶菌酶解法、普通試劑法、蛋白酶K法檢出時(shí)間為12～13 h；FDA BAM方法檢出率為11.4％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時(shí)間為7 d：DFI方法檢出率為11.4％，敏

7、感性為80％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時(shí)間為5 d；OK方法檢出率為17.1％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為91.4％，檢出時(shí)間為5 d。四種方法的敏感性相同，PCR方法的特異性略低于BAM方法和DFI方法，但高于OK方法，PCR方法的符合率稍低于BAM方法和DFI方法但高于OK方法，比較之PCR方法檢測(cè)時(shí)間比其他三種方法大大縮短?？傊?，利用FTA濾膜，采用PCR技術(shù)可只需增菌2 h檢測(cè)到嬰兒配方奶粉