CD151-integrin復合體調(diào)節(jié)體內(nèi)外腫瘤細胞生長、遷移和侵襲及相關機制研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤一直以來都是嚴重危害人類健康的一類疾病，其起病隱匿、進展迅速、惡性程度高、治療困難、死亡率高、多數(shù)預后較差的特點，使得一些腫瘤患者在被確診時已是中晚期，失去了治療的機會。我國是多種常見腫瘤如肺癌、肝癌等的高發(fā)區(qū)。如何阻斷腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療研究的焦點。腫瘤的基因治療，無論是在基礎研究還是臨床研究中，一直以來都是備受關注的熱點問題。CD151是四次跨膜蛋白超家族中的重要成員之一，能夠與多種不同的細胞內(nèi)

2、蛋白質(zhì)分子結合在一起，參與促進腫瘤細胞的運動，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。研究表明，調(diào)節(jié)細胞運動和遷移是CD151分子最顯著地特征。臨床試驗結果已經(jīng)證實，CD151參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，與多種腫瘤的不良預后存在著密切的關系。為了進一步明確CD151及其相關分子復合物在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，構建了RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體，特異性的破壞CD151與整合素分子之

3、間的聯(lián)系。并設計合成針對CD151基因的SIRNA序列，沉默CD151表達。本實驗研究的最終目的在于探索CD151在體內(nèi)外腫瘤生長、侵襲和遷移中的重要作用，以及破壞CD151與整合素分子α3,α6,β1亞基復合體的形成，對體內(nèi)外腫瘤細胞生長、存活、遷移和侵襲的重要影響，包括對細胞TEM之間信號傳遞的分子機制。
　　方法：
　　1.構建RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD1

4、51-AAA194-196突變體質(zhì)粒及RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒。并用質(zhì)粒大提試劑盒對構建成功的三種質(zhì)粒進行大量提取。
　　2.設計并合成特異性針對CD151的小分子干擾RNA即CD151-SIRNA，及亂序的陰性對照SIRNA。
　　3.分別將前面準備好的各實驗組質(zhì)粒DNA及各實驗組SIRNA通過脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染的方法瞬時轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞、宮頸癌Hela細胞中，觀察其對三種腫瘤細胞生物學行為

5、的影響。
　　4.免疫共沉淀實驗檢測比較重組體質(zhì)粒RAAV-CD151、突變體質(zhì)粒RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196及陰性對照質(zhì)粒RAAV-GFP轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞中CD151與整合素α3、α6、β1亞基結合力的改變。
　　5.MTT法、transwell趨化小室法分別檢測三種腫瘤細胞經(jīng)過干預處理后體外增殖、遷移及侵襲能力的差異。
　　6.Western blot檢測CD

6、151表達缺失或CD151-整合素復合體破壞，對腫瘤細胞體外增殖、遷移、侵襲相關的信號通路蛋白分子的磷酸化影響。
　　7.檢測CD151-整合素復合體在人腫瘤組織及癌旁組織中的表達及組織學定位。
　　8.構建裸鼠肝癌移植瘤模型，并通過尾靜脈注射各實驗組質(zhì)粒，觀察CD151-整合素復合體對腫瘤細胞體內(nèi)生長、存活、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。Western blot檢測有關信號通路中蛋白質(zhì)分子磷酸化的改變。同時免疫熒光雙標記實驗觀察各實驗

7、組中CD151與整合素分子在裸鼠腫瘤組織中的共定位。
　　結果：
　　1.成功構建RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒及RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒。
　　2.成功完成CD151-SIRNA的設計及合成，同時合成相應的陰性對照SIRNA。
　　3.RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-

8、RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒、RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒；以及CD151-SIRNA和陰性對照SIRNA向人肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞、宮頸癌Hela細胞內(nèi)的瞬時轉(zhuǎn)染，并用western blot檢測，實現(xiàn)對目標蛋白的表達調(diào)節(jié)，符合后面的實驗要求。
　　4.免疫共沉淀檢測結果證實RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，腫瘤細胞內(nèi)CD

9、151表達上調(diào)，但CD151與整合素α3、α6、β1亞基結合能力被破壞。
　　5.CD151-整合素復合體能有效促進腫瘤細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，破壞CD151與整合素分子之間的聯(lián)系，其相應的生物學功能遭到破壞。同時，腫瘤細胞中CD151表達受抑制以后，細胞的體外增殖、遷移和侵襲力亦顯著下調(diào)。
　　6.CD151-整合素復合體促進細胞信號蛋白FAK，P130CAS磷酸化激活，失去了與整合素的完整性結合，相應的FAK，P

10、130CAS磷酸化激活受到抑制。
　　7.人肺癌、結腸癌組織中CD151基因及蛋白表達水平明顯高于周圍正常組織，且CD151與整合素分子共同定位于腫瘤組織中細胞周邊。
　　8.成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型，并完成對裸鼠腫瘤CD151的表達調(diào)節(jié)。CD151表達上調(diào)能有效促進裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。保護腫瘤細胞免受順鉑誘導的凋亡。同時CD151-整合素復合體定位于細胞周邊連接的部位，破壞CD151與整合素的聯(lián)系，上述