蛋白免疫印跡及免疫組化檢測XIAP和Smac在急性胰腺炎腺泡細胞中的表達.pdf

1、目的:研究急性胰腺炎(actlte pancreatitis,AP)大鼠腺泡細胞中X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)及caspase的第二個線粒體激活因子/低等電點的IAP直接結(jié)合蛋白(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding proteinwith low PI,Smac/DIABLO)的表達及其與AP嚴(yán)重程度的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.

2、健康雄性SD大鼠54只,隨機分成急性水腫型胰腺炎(AEP)組、急性壞死型胰腺炎(ANP)組及假手術(shù)(sham)組,每組各18只。采用膽胰管末端逆行注射l％牛磺膽酸鈉和3.5％?；悄懰徕c(0.1ml/100g體重)分別制備AEP及ANP模型。Sham組模擬造模手術(shù)情況,輕柔翻動胰腺及十二指腸數(shù)次,關(guān)腹。
　　 2.造模成功后3、6、12h3個時點處死大鼠,各個時點各組6只。各時點由下腔靜脈抽取大鼠靜脈血液8～10ml,離心后留取上

3、層血清,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒迈r胰腺組織,一部分固定于4％多聚甲醛液中,待行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)法檢測；另一部分置凍存管中于液氮中保存,待行蛋白免疫印跡(Western Blote)檢測。
　　 3.人工碘比色法檢測血清淀粉酶(AMY)含量。
　　 4.胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)(HE染色法)檢查及評分,免疫組織化學(xué)SP二步法定性檢測胰腺組織中XIAP及Smac的表達,Western Blote半定量檢測XIAP及S

4、mac的表達水平。
　　 5.計量資料以((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,進行正態(tài)性檢驗和方差齊性分析、完全隨機設(shè)計單因素方差分析,結(jié)果以p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 大鼠AP模型建立成功。同sham組比較,AEP和ANP組大鼠胰腺組織在各個不同時點均有不同程度的病理損害,且血清淀粉酶顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中ANP各組別升高程度更加明顯(P<0.

5、05)。免疫組織化學(xué)染色顯示,XIAP和Smac在大鼠正常胰腺組織腺泡細胞中均呈弱陽性表達,XIAP在ANP組的表達較sham組和AEP組明顯增強,Smac在AEP組表達較ANP及sham組增強。Western Blot結(jié)果顯示,XIAP的表達:Sham組和AEP組隨著造模后時間的延長其表達量差別并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但ANP組隨著造模后時間的延長其表達量逐漸增高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在炎癥發(fā)展的中后期(6h

6、及12h),ANP組較AEP組及Sham組表達明顯增高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Smac的表達:Sham組和ANP組,各時間點亞組Smac表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AEP組中,造模后隨時間延長Smac表達明顯增高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在炎癥發(fā)展的中后期(6h及12h),AEP組較ANP組及Sham組表達明顯增高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 急性胰