PKCγ調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、研究背景：神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP)是臨床常見但卻缺乏有效治療手段的癥狀和疾病，其發(fā)生、發(fā)展和維持的生物學機制及其治療是一個具有挑戰(zhàn)性的研究課題。NP發(fā)病機制目前尚不完全清楚，且缺乏有效的治療措施，因此對NP及其相關(guān)的疼痛分子靶機理進行深入研究十分重要。眾多研究表明，PKCγ在NP中樞敏化過程中起著非常重要的作用，是慢性疼痛基因治療重要的分子靶，從而對PKCγ調(diào)控NP的確切機制值得深入研究。本研究擬從蛋白質(zhì)

2、組學結(jié)合RNA干擾技術(shù)探討NP重要分子靶的作用機理，不僅有利于NP病理機制研究方法的完善，而且能為NP研究提供新的實驗依據(jù)和思路。
　　 目的：為闡明PKCγ調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的病理機制，本研究構(gòu)建介導PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元，觀察shRNA在體外對PKCγ表達的干擾效應(yīng)。鞘內(nèi)注射介導PKCγ基因shRNA的慢病毒載體于脊髓水平體內(nèi)沉默PKCγ基因表達，并觀察其對坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致

3、神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。應(yīng)用RNA干擾聯(lián)合蛋白質(zhì)組學技術(shù)高通量檢測與PKCγ基因功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，篩選鑒定出PKCγ調(diào)控NP的特異蛋白，發(fā)現(xiàn)NP治療新的靶點。
　　 方法：針對已篩選確定的PKCγ基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)AgeⅠ和EcoRI酶切后的pGCSIL-GFP載體[含U6啟動子和綠色熒光蛋白(GFP)]連接產(chǎn)生重組慢病毒載體pGCSIL-shPKCγ-GFP(

4、LV-shPKCγ)，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定，從而構(gòu)建出介導PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體。將LV-shPKCγ、pHelper1.0和pHelper2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞，包裝后產(chǎn)生慢病毒，逐孔稀釋滴度法測定慢病毒滴度。將慢病毒體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞，神經(jīng)元細胞分為三組：Con組，未感染任何病毒的細胞組(Control)；NC組，加陰性對照病毒感染的細胞組(Negative Control)；RNAi

5、組，加RNA干擾靶點病毒感染的細胞組(Knock Down)，以Con組為對照，慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元3天后，觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況。以Con組及NC組為對照，慢病毒感染神經(jīng)元細胞5天后，Real-time PCR和Western blot檢測PKCγ基因mRNA和蛋白表達水平的干擾效率。
　　 成年雄性SD大鼠，體重260～320g，鞘內(nèi)置管成功5天后，建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致神經(jīng)病理性疼痛模型，隨機分為以下4組：C

6、CI+生理鹽水(NS組，n=24)；CCI+pGCSIL-GFP空白載體組(LV-NC組，n=32)；CCI+pGCSIL-shPKCy-GFP載體組(LV-shPKCγ組，n=32)；假手術(shù)組+生理鹽水(Sham組，n=24)，Sham組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)分支，不結(jié)扎。CCI術(shù)后第5天，大鼠鞘內(nèi)分別注射兩種不同劑量NS，LV-NC或LV-shPKCγ各5μl及10μl。鞘內(nèi)給藥7天后各組各取16只大鼠斷頭處死，取L4-L5脊髓腰膨大處

7、，Real-time PCR檢測PKCγ mRNA的表達，Western blot法檢檢測脊髓組織PKCγ蛋白的表達。LV-NC組和LV-shPKCy組各取8只大鼠觀察GFP脊髓轉(zhuǎn)染效果。所有大鼠均測基礎(chǔ)痛閾值，并在第3天、1、2、3、4、5、6周時測定大鼠右后爪機械痛閾值(PMWT)和熱痛閾值(PWTL)。
　　 建立大鼠鞘內(nèi)置管及坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)致神經(jīng)病理性疼痛動物模型，鞘內(nèi)注射介導PKCγ基因RNA干擾的重組慢病毒載

8、體IN-shPKCγ，脊髓水平穩(wěn)定沉默CCI致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的PKCγ基因表達，然后建立空白載體組(CCI+LV-NC，LV-NC組，n=8)和慢病毒載體介導RNA干擾組(CCI+-LV-shPKCγ，LV-shPKCγ組，n=8)兩組大鼠脊髓組織的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)表達譜，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)結(jié)合生物信息學對兩組大鼠脊髓腰段蛋白質(zhì)表達譜的部分差異表達蛋白質(zhì)點進行分析和鑒定，We

9、stern blot驗證其部分差異表達的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：PCR鑒定和測序證實，本研究成功構(gòu)建了PKCγ shRNA的重組慢病毒載體LV-shPKCγ。包裝慢病毒后，濃縮慢病毒懸液的滴度為1×109 TU/ml。慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染實驗大鼠神經(jīng)元致PKCγ基因的mRNA和蛋白表達水平均一致降低，與對照組比較，干擾組mRNA水平干擾效率達95％(P<0.05)，干擾組蛋白表達水平干擾效率達80％以上(P<0.05)。鞘內(nèi)注射LV

10、-shPKCγ7天后，與對照組比較，脊髓PKCγmRNA及蛋白質(zhì)表達水平顯著降低(P<0.05)；LV-NC組和LV-shPKCγ組脊髓背角均可見大量GFP綠色熒光蛋白表達：與對照組比較，LV-shPKCγ組PMWT和PTWL較注射前明顯延長，于第1周開始差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，鎮(zhèn)痛效應(yīng)可持續(xù)6周。
　　 LV-NC組和LV-shPKCγ組大鼠腰段脊髓組織雙向電泳圖譜中各分離出清晰的約1050個蛋白質(zhì)點，兩組蛋白質(zhì)斑點

11、總體分布相似，2-DE圖譜中分離出明顯差異表達的36個蛋白質(zhì)點，與LV-NC組比較LV-shPKCγ組有19個蛋白點表達顯著上調(diào)，17個蛋白點表達顯著下調(diào)。選取其中20個豐度較高、分辨清楚的差異蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定分析，共獲得20個肽質(zhì)量指紋圖譜。利用Mascot查詢軟件搜索，共鑒定出18個差異表達蛋白質(zhì)。生物信息學分析初步鑒定的蛋白質(zhì)分類為：能量代謝酶類相關(guān)蛋白，抗氧化蛋白，分子伴侶、熱休克蛋白，突觸相關(guān)蛋白，

12、細胞骨架蛋白等。涉及到細胞代謝、分子基因表達調(diào)控、突觸傳遞等眾多事件，Western blot驗證了SNAP-25、TERA及AR三個部分差異表達的蛋白質(zhì)，同蛋白質(zhì)組學結(jié)果的表達變化水平相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功構(gòu)建了介導PKCγ基因shRNA重組慢病毒載體(LV-shPKCγ)。
　　 2.本研究構(gòu)建的重組慢病毒載體(LV-shPKCγ)能有效下調(diào)體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞PKCγ基因mRNA和