染色體微陣列技術(shù)在先天性唇腭裂畸形患者中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　1、探討全基因組高分辨率染色體微陣列技術(shù)(chromosome microarrayanalysis, CMA)在先天性唇腭裂畸形患者中的應(yīng)用價(jià)值。
　　2、探討CMA技術(shù)在單純性唇裂(isolated cleft lip, CL)、單純性腭裂(isolated cleft palate, CP)以及唇腭裂（cleft lip with palate,CLP）患者之間其致病性拷貝數(shù)變異(copy number v

2、ariants,CNVs)檢出率的差異性。
　　3、為建立先天性唇腭裂畸形的遺傳學(xué)診斷以及產(chǎn)前診斷的臨床操作流程提供理論依據(jù)。
　　4、為探討應(yīng)用CMA技術(shù)在先天性唇腭裂畸形遺傳學(xué)診斷及咨詢(xún)中如何最大程度減少臨床意義不明確的CNVs（variants of unknown significance,VOUS）結(jié)果解釋困惑的策略提供實(shí)驗(yàn)室支持。
　　方法:
　　1、選取自2012年8月至2013年8月在廣州市婦女兒

3、童醫(yī)療中心口腔科確診、并接受手術(shù)矯正治療的各種類(lèi)型先天性唇腭裂畸形、伴或不伴發(fā)其他畸形的臨床患兒共計(jì)33例核心家系樣本：非綜合癥型唇腭裂患兒29例，包含了單純性CL患兒10例，單純性CP患兒8例，CLP患兒11例；綜合征型唇腭裂患兒4例，包含了唇腭裂畸形合并先天性心臟病患兒3例，Van der Woude’s綜合癥患兒1例。
　　2、所有病例均事先經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析，只有染色體核型正常者才進(jìn)一步行CMA分析。
　　3

4、、分別使用Qiagen DNA提取試劑盒從患者外周血中提取基因組DNA，并使用NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)DNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)量。
　　4、根據(jù)美國(guó)Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平臺(tái)（195萬(wàn)拷貝數(shù)探針和75萬(wàn)SNP探針）的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程對(duì)樣本DNA進(jìn)行處理。
　　5、使用相配套的CHAS軟件對(duì)掃描芯片產(chǎn)生的.CEL文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　6、根據(jù)DGV（含正常人的CNVs）、DECIPHE

5、R（含患者的表型及致病性片段）、OMIM（含已知的致病基因）、CAGdb、ISCA（含良性與致病性的CNVs）、UCSC Genome Browser（顯示片段中基因的內(nèi)容及功能）及PUBMED等以及本實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行在線(xiàn)比對(duì)，判斷CNVs的性質(zhì)。
　　7、針對(duì)臨床意義不明確的CNVs結(jié)果，進(jìn)一步行父母樣本檢測(cè)進(jìn)行綜合家系分析，明確CNVs的性質(zhì)。
　　8、使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time poly

6、merase chain reaction, RT-PCR）對(duì)致病性CNVs進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、全部33例患兒均成功進(jìn)行了全基因組高分辨率CMA技術(shù)檢測(cè)，CMA結(jié)果提示6例患兒含有致病性CNVs，致病性CNVs檢出率為18.2％(6/33)；26例患兒含有良性CNVs，良性CVNs檢出率為78.8%（26/33）；1例患兒含有臨床意義不明確的CNVs（VOUS），VOUS檢出率為3.0%（1/33）。
　　

7、2、CMA結(jié)果提示6例含致病性CNVs的患兒中，4例（13.8%，4/29）來(lái)源于非綜合癥型唇腭裂患兒，包含了3例單純性 CP患兒（37.5%，3/8），1例 CLP患兒（9.1%，1/11）；致病性CNVs分別為10q22.2-q22.3微缺失（1766kb）、20p12.1微缺失（184kb）、22q11.21-q11.23微缺失（3163kb）、8p23.1微重復(fù)（198kb）；此外，10q22.2-q22.3區(qū)域中的MYST4基

8、因，20p12.1區(qū)域中的MACROD2基因是新發(fā)現(xiàn)的先天性唇腭裂可疑致病基因。2例（50%，2/4）來(lái)源于綜合癥型唇腭裂患兒，致病性 CNVs分別為18q12.3微重復(fù)（638kb）、6q26微缺失（389kb）。
　　3、CMA結(jié)果提示26例含良性CNVs的患兒中，19例患兒的CNVs存在于DGV數(shù)據(jù)庫(kù)/CHOP數(shù)據(jù)庫(kù)中，最常見(jiàn)的4種（P≥5%）分別為8p11.2微缺失/微重復(fù)（11.9%）、14q32.33微重復(fù)（18.1%

9、）、14q11.2微缺失（5.8%）、22q11.22微重復(fù)（11.9%）；4例患兒的CNVs來(lái)源于正常父母一方，分別為9q31.1微重復(fù)、10p12.33微缺失、7q31.1微缺失、Xp22.33微重復(fù)，為國(guó)際上首次報(bào)道。
　　4、CMA結(jié)果提示1例患兒含有臨床意義仍然不明確CNVs，該VOUS為5q21.1微缺失（110kb）。
　　結(jié)論:
　　1、全基因組高分辨率 CMA技術(shù)在先天性唇腭裂畸形而染色體核型正常的患

10、兒中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，該技術(shù)能夠?qū)⒅虏⌒?CNVs的總體檢出率額外提高18.2%，并且具有識(shí)別新的致病基因的能力。
　　2、CMA技術(shù)對(duì)唇腭裂畸形合并其他結(jié)構(gòu)異常的綜合征型患兒其致病性 CNVs檢出率高于單一唇腭裂畸形的非綜合征型唇腭裂患兒（50%vs13.8%）。
　　3、在非綜合征性唇腭裂患兒中，致病性 CNVs檢出率從高到低排列為單純性CP(37.5%)>CLP(9.1%)>單純性CL（0）。單純性CL患兒其基因組發(fā)