染色體微陣列技術在先天性唇腭裂畸形患者中的應用.pdf

1、目的:
　　1、探討全基因組高分辨率染色體微陣列技術(chromosome microarrayanalysis, CMA)在先天性唇腭裂畸形患者中的應用價值。
　　2、探討CMA技術在單純性唇裂(isolated cleft lip, CL)、單純性腭裂(isolated cleft palate, CP)以及唇腭裂（cleft lip with palate,CLP）患者之間其致病性拷貝數(shù)變異(copy number v

2、ariants,CNVs)檢出率的差異性。
　　3、為建立先天性唇腭裂畸形的遺傳學診斷以及產前診斷的臨床操作流程提供理論依據。
　　4、為探討應用CMA技術在先天性唇腭裂畸形遺傳學診斷及咨詢中如何最大程度減少臨床意義不明確的CNVs（variants of unknown significance,VOUS）結果解釋困惑的策略提供實驗室支持。
　　方法:
　　1、選取自2012年8月至2013年8月在廣州市婦女兒

3、童醫(yī)療中心口腔科確診、并接受手術矯正治療的各種類型先天性唇腭裂畸形、伴或不伴發(fā)其他畸形的臨床患兒共計33例核心家系樣本：非綜合癥型唇腭裂患兒29例，包含了單純性CL患兒10例，單純性CP患兒8例，CLP患兒11例；綜合征型唇腭裂患兒4例，包含了唇腭裂畸形合并先天性心臟病患兒3例，Van der Woude’s綜合癥患兒1例。
　　2、所有病例均事先經常規(guī)G顯帶染色體核型分析，只有染色體核型正常者才進一步行CMA分析。
　　3

4、、分別使用Qiagen DNA提取試劑盒從患者外周血中提取基因組DNA，并使用NanoDrop分光光度計對DNA的濃度和純度進行測量。
　　4、根據美國Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平臺（195萬拷貝數(shù)探針和75萬SNP探針）的標準實驗操作流程對樣本DNA進行處理。
　　5、使用相配套的CHAS軟件對掃描芯片產生的.CEL文件進行數(shù)據分析。
　　6、根據DGV（含正常人的CNVs）、DECIPHE

5、R（含患者的表型及致病性片段）、OMIM（含已知的致病基因）、CAGdb、ISCA（含良性與致病性的CNVs）、UCSC Genome Browser（顯示片段中基因的內容及功能）及PUBMED等以及本實驗室的內部數(shù)據庫對分析結果進行在線比對，判斷CNVs的性質。
　　7、針對臨床意義不明確的CNVs結果，進一步行父母樣本檢測進行綜合家系分析，明確CNVs的性質。
　　8、使用實時熒光定量PCR（real-time poly

6、merase chain reaction, RT-PCR）對致病性CNVs進行驗證。
　　結果:
　　1、全部33例患兒均成功進行了全基因組高分辨率CMA技術檢測，CMA結果提示6例患兒含有致病性CNVs，致病性CNVs檢出率為18.2％(6/33)；26例患兒含有良性CNVs，良性CVNs檢出率為78.8%（26/33）；1例患兒含有臨床意義不明確的CNVs（VOUS），VOUS檢出率為3.0%（1/33）。
　　

7、2、CMA結果提示6例含致病性CNVs的患兒中，4例（13.8%，4/29）來源于非綜合癥型唇腭裂患兒，包含了3例單純性 CP患兒（37.5%，3/8），1例 CLP患兒（9.1%，1/11）；致病性CNVs分別為10q22.2-q22.3微缺失（1766kb）、20p12.1微缺失（184kb）、22q11.21-q11.23微缺失（3163kb）、8p23.1微重復（198kb）；此外，10q22.2-q22.3區(qū)域中的MYST4基

8、因，20p12.1區(qū)域中的MACROD2基因是新發(fā)現(xiàn)的先天性唇腭裂可疑致病基因。2例（50%，2/4）來源于綜合癥型唇腭裂患兒，致病性 CNVs分別為18q12.3微重復（638kb）、6q26微缺失（389kb）。
　　3、CMA結果提示26例含良性CNVs的患兒中，19例患兒的CNVs存在于DGV數(shù)據庫/CHOP數(shù)據庫中，最常見的4種（P≥5%）分別為8p11.2微缺失/微重復（11.9%）、14q32.33微重復（18.1%

9、）、14q11.2微缺失（5.8%）、22q11.22微重復（11.9%）；4例患兒的CNVs來源于正常父母一方，分別為9q31.1微重復、10p12.33微缺失、7q31.1微缺失、Xp22.33微重復，為國際上首次報道。
　　4、CMA結果提示1例患兒含有臨床意義仍然不明確CNVs，該VOUS為5q21.1微缺失（110kb）。
　　結論:
　　1、全基因組高分辨率 CMA技術在先天性唇腭裂畸形而染色體核型正常的患

10、兒中具有重要的應用價值，該技術能夠將致病性 CNVs的總體檢出率額外提高18.2%，并且具有識別新的致病基因的能力。
　　2、CMA技術對唇腭裂畸形合并其他結構異常的綜合征型患兒其致病性 CNVs檢出率高于單一唇腭裂畸形的非綜合征型唇腭裂患兒（50%vs13.8%）。
　　3、在非綜合征性唇腭裂患兒中，致病性 CNVs檢出率從高到低排列為單純性CP(37.5%)>CLP(9.1%)>單純性CL（0）。單純性CL患兒其基因組發(fā)