CCDC170-C6ORF97的亞細(xì)胞定位及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　基因CCDC170/C6ORF97（簡(jiǎn)寫為CCDC170）位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂6q25.1區(qū)域，與雌激素受體α(ESR1)臨近，是ESRl上游的開放讀碼框。近來，已證明CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座是參與遺傳性及散發(fā)性乳腺癌進(jìn)展的理想候選基因，CCDC170/C6ORF97與乳腺癌易感性有明確的相關(guān)性。近來的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)提示，CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座(6q2

2、5.1)上的12個(gè)變異與乳腺癌和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。研究者識(shí)別了位于CCDC170/C6ORF97-ESR1基因間區(qū)域的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs2046210。許多相關(guān)研究已開始探討不同人群中這個(gè)GWAS基因座與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。人們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于雌激素受體陽(yáng)性乳腺腫瘤，rs2046210在雌激素受體陰性乳腺腫瘤中有更強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，提示這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)變異很可能不依賴于ESR1。
　　相關(guān)研究已報(bào)道了散發(fā)性乳腺癌及

3、其他癌癥中的CCDC170無義突變(如pE48和pQ405)。近來有研究報(bào)道，通過高通量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了從ESR1第二個(gè)非編碼外顯子到 CCDC170第六個(gè)和/或第七個(gè)外顯子的腫瘤特異性基因重排。進(jìn)一步研究表明，氨基末端(N末端)截短的CCDC170蛋白(p.593-715)是由這個(gè)ESR1-CCDC170基因座重排所致。這個(gè)截短蛋白的表達(dá)增加了乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性并增強(qiáng)了正常肌上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。大量的研究表明，CCDC170蛋白的各種

4、變異在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。因此，很有必要對(duì)這個(gè)未知基因的特征及功能進(jìn)行深入研究。但至今為止，全長(zhǎng)CCDC170蛋白及其突變蛋白的亞細(xì)胞定位、在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚未見報(bào)道。
　　本研究擬首次研究全長(zhǎng)CCDC170蛋白及其突變蛋白的亞細(xì)胞定位，并探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制。
　　第一部分 CCDC170及其突變蛋白的亞細(xì)胞定位研究
　　目的
　　觀察全長(zhǎng)CCDC170蛋白及其突變蛋白在腫

5、瘤細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，并探討其細(xì)胞內(nèi)定位的可能機(jī)制。
　　材料與方法
　　1.應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建攜帶GFP、CCDC170基因及其截短突變體的重組質(zhì)粒： Tight質(zhì)粒（TRE-Tight-GFP、TRE-Tight-GFP-CCDC170、TRE-Tight-GFP-Q405、TRE-Tight-GFP-E48、TRE-Tight-GFP-p.593-715）、非Tight質(zhì)粒（pCMV6-GFP-p.593-715）

6、。用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　2應(yīng)用定點(diǎn)誘變技術(shù)，構(gòu)建攜帶CCDC170基因第1810位及第2047位核苷酸點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒：Tight質(zhì)粒和非Tight質(zhì)粒。用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　3.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細(xì)胞，以western blotting方法檢測(cè)全長(zhǎng)CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建準(zhǔn)確無誤。
　　4.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細(xì)胞及Hela細(xì)胞，以GFP

7、抗體、RCAS1抗體行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下拍照，觀察全長(zhǎng)CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白在MCF7-tet-on細(xì)胞及Hela細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果
　　1. CCDC170基因重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)驗(yàn)證的結(jié)果顯示，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細(xì)胞，以GFP抗體、CCDC170抗體行western blotting分析，可見“GFP-CCDC170”融合蛋白或“GFP-截短CC

8、DC170”融合蛋白的準(zhǔn)確表達(dá)。
　　2. CCDC170在 MCF7-tet-on細(xì)胞內(nèi)定位的研究結(jié)果顯示，全長(zhǎng) CCDC170蛋白定位于高爾基體，其1810位核苷酸及2047位核苷酸點(diǎn)突變的突變蛋白亦定位于高爾基體，與全長(zhǎng) CCDC170蛋白無明顯差別。其截短突變蛋白 pQ405則定位于細(xì)胞漿。
　　3. CCDC170及其截短CCDC170蛋白在Hela細(xì)胞內(nèi)定位的研究結(jié)果顯示，全長(zhǎng)CCDC170蛋白定位于高爾基體，“

9、GFP-截短CCDC170”融合蛋白的亞細(xì)胞定位是：GFP-pQ649定位于細(xì)胞核周邊，GFP-pQ405、GFP-pV264定位于細(xì)胞漿，GFP-pE48、GFP-p.593-715定位于全細(xì)胞。截短CCDC170蛋白可導(dǎo)致野生型CCDC170失去正常的亞細(xì)胞定位。
　　4. CCDC170通過羧基末端(C末端)附著于高爾基體表面，在CCDC170的C末端，有2個(gè)序列(以區(qū)域a和b表示)可能對(duì)CCDC170的高爾基體定位有重要作

10、用。直接的C末端（區(qū)域b）是特定的高爾基體附著所必需的，但這對(duì)高爾基體的定位尚不足夠，通過直接C末端(區(qū)域 b)的附著可能需要第二序列(區(qū)域 a)。
　　第二部分 CCDC170在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制
　　目的
　　觀察CCDC170對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、移動(dòng)能力的影響，觀察CCDC170與相關(guān)腫瘤分子標(biāo)記物的表達(dá)、微管蛋白乙?；年P(guān)系，檢測(cè)CCDC170在乳腺癌細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，探討CC

11、DC170在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制。
　　材料與方法
　　1．以攜帶野生型CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-tet-on細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)GFP陽(yáng)性的MCF7-tet-on細(xì)胞中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
　　2．以攜帶野生型 CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 MCF7-tet-on細(xì)胞，通過軟瓊脂細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞集落形成數(shù)目，檢測(cè)轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒的MCF7-tet-on細(xì)胞的增

12、殖、移動(dòng)能力。
　　3.以攜帶野生型CCDC170及其截短基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting技術(shù)，觀察CCDC170與p53、裂解PARP-1、EGFR、Gab1、pSTAT3、AKT、pAKT等腫瘤分子標(biāo)記物表達(dá)的關(guān)系。
　　4.以CCDC170 SiRNA轉(zhuǎn)染MCF7-tet-on細(xì)胞，行CCDC170基因敲低，并以CCDC170基因敲低的MCF7-tet-on細(xì)胞行細(xì)胞劃痕實(shí)

13、驗(yàn)，觀察CCDC170在乳腺癌細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　5.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，觀察野生型CCDC170及其截短蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞微管蛋白乙?；挠绊憽?br>　　結(jié)果
　　1.免疫熒光結(jié)果顯示，在 GFP陽(yáng)性表達(dá)的MCF-7-tet-on細(xì)胞中，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405三組中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分別為67％、44%、48%。pCMV6-GFP-C

14、CDC170及pCMV6-GFP-Q405組的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于 pCMV6-GFP組（P＜0.05），pCMV6-GFP-CCDC170與pCMV6-GFP-Q405組相比則無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，在GFP高表達(dá)的MCF-7-tet-on細(xì)胞中，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-p.593-715三組中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分別為57%、

15、32%、71%，pCMV6-GFP-CCDC170組的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于pCMV6-GFP組（P＜0.001），pCMV6-GFP-p.593-715組的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯高于pCMV6-GFP組（P＜0.05）。而在GFP低表達(dá)的MCF-7-tet-on細(xì)胞中，pCMV6-GFP-CCDC170組的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于pCMV6-GFP組（P＜0.05），pCMV6-GFP-p.593-715組的K

16、i-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比與pCMV6-GFP組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.軟瓊膠細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405組形成的細(xì)胞集落數(shù)目少于pCMV6-GFP組，而pCMV6-GFP-p.593-715組形成的細(xì)胞集落數(shù)目多于pCMV6-GFP組，pCMV6-GFP-CCDC170與pCMV6-GFP-Q405組形成的細(xì)胞集落數(shù)目相仿。
　　4.Western

17、 blotting結(jié)果顯示，pCMV6-GFP-CCDC170組裂解PARP-1的表達(dá)強(qiáng)度高于 pCMV6-GFP-p.593-715組及 pCMV6-GFP組（對(duì)照）；至于 p53、EGFR、Gab1、pSTAT3、AKT、pAKT的表達(dá)強(qiáng)度，pCMV6-GFP-CCDC170組與pCMV6-GFP-p.593-715組及pCMV6-GFP組相比，無明顯差異。
　　5. CCDC170敲低及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞劃痕愈合

18、時(shí)間的推移，對(duì)照siRNA組的細(xì)胞缺損區(qū)域明顯減小，siRNA A、siRNA C組的細(xì)胞缺損區(qū)域亦有所減小，但減少程度較弱。24、48、72、96小時(shí)對(duì)照siRNA組的細(xì)胞劃痕愈合率分別為17.80%、34.68%、48.71%、61.35%，siRNA A組為7.23%、16.98%、26.37%、38.90%，siRNA C組為14.25%、24.25%、31.61%、43.21%，siRNA A、siRNA C組的細(xì)胞劃痕愈合速

19、度明顯慢于對(duì)照siRNA組。
　　6.免疫熒光結(jié)果顯示，pCMV6-GFP、pCMV6-GFP-CCDC170、pCMV6-GFP-Q405、pCMV6-GFP-p.593-715轉(zhuǎn)染的hela細(xì)胞中均有強(qiáng)度不等的乙?；⒐艿鞍妆磉_(dá)（紅色熒光）。計(jì)算紅色熒光的校正總細(xì)胞熒光（CTCF），可見 pCMV6-GFP-CCDC170組的CTCF值最高，pCMV6-GFP-Q405組次之，pCMV6-GFP組及pCMV6-GFP-p.59

20、3-715組最低。pCMV6-GFP-CCDC170組、pCMV6-GFP-Q405組的CTCF值顯著大于 pCMV6-GFP組（P＜0.05），而pCMV6-GFP-p.593-715組的CTCF值與 pCMV6-GFP組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論
　　1.野生型CCDC170蛋白定位于腫瘤細(xì)胞的高爾基體，是定位于高爾基體的卷曲螺旋蛋白家族成員。截短CCDC170蛋白可導(dǎo)致野生型CCDC170失去正常的亞細(xì)

21、胞定位。
　　2. CCDC170通過C末端附著到高爾基體表面，在CCDC170的C末端，有兩個(gè)特定序列可能對(duì)CCDC170在高爾基體的定位有影響。
　　3.在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及細(xì)胞侵襲時(shí)，野生型 CCDC170與截短CCDC170蛋白具有不同的作用。過表達(dá)的野生型CCDC170顯著地抑制細(xì)胞的增殖及細(xì)胞移動(dòng)、侵襲，pQ405亦抑制細(xì)胞的增殖，而p.593-715則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　4.野生型CCDC

22、170及截短CCDC170蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位、功能上均存在差異，提示 CCDC170的亞細(xì)胞定位和致瘤潛能之間有相關(guān)性，即通過基因突變，CCDC170蛋白在高爾基體正常定位的破壞可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化，進(jìn)而影響乳腺癌病情的進(jìn)展。
　　5.基礎(chǔ)表達(dá)的野生型 CCDC170促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,過表達(dá)的野生型CCDC170則顯著地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。過表達(dá)的野生型 CCDC170可能通過調(diào)節(jié)PARP-1的裂解促進(jìn)乳腺癌細(xì)

23、胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；亦可能通過促進(jìn)微管蛋白乙?；种萍?xì)胞增殖。野生型CCDC170及截短CCDC170蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的不同影響可能與微管蛋白乙?；嘘P(guān)。
　　6.本研究首次闡述了新的乳腺癌相關(guān)蛋白CCDC170的亞細(xì)胞定位及功能，揭示了CCDC170在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及作用機(jī)制。填補(bǔ)了該研究領(lǐng)域的空白。以CCDC170相關(guān)通路異常作為研究目標(biāo)，可能是乳腺癌治療的新策略，將揭示乳腺癌靶向治療的新途徑，有望改