Dishevelled-1，3分別通過β-catenin和p120ctn影響肺癌細(xì)胞侵襲并與不良預(yù)后相關(guān).pdf

1、目的：
　　 腫瘤的形成與發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多階段的病理過程,有眾多的信號(hào)傳導(dǎo)通路參與這一過程。其中Wnt通路的作用,日益受到人們的重視。Dishevelled(Dvl)是Wnt通路中位于上游的正向調(diào)節(jié)因子,介導(dǎo)Wnt信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的三條通路,即Wnt/β-catenin通路,非經(jīng)典Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。人類Dishevelled(Dvl)家族有Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3三個(gè)成員,在非小細(xì)胞肺癌

2、中均存在過表達(dá),但他們與患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚,不同亞型對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響和可能的機(jī)制也需要進(jìn)一步研究和證實(shí)。
　　 方法
　　 1、材料
　　 80例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本收集自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科1998-2005年存檔蠟塊。全部標(biāo)本均有術(shù)后隨訪記錄。標(biāo)本經(jīng)4％中性甲醛固定,石蠟包埋,HE常規(guī)染色后明確診斷。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定
　　 標(biāo)本用中性福爾

3、馬林溶液固定,石蠟包埋,制成4μm切片,經(jīng)脫蠟,脫苯,水化后,采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測(cè)Dvl-1,Dvl-3,β-catenin和p120ctn蛋白表達(dá)。單克隆抗體小鼠抗人Dvl-1,Dvl-3單克隆抗體,鼠抗人β-catenin單克隆抗體,鼠抗人p120ctn單克隆抗體4℃孵育過夜。以正常支氣管粘膜上皮細(xì)胞著色強(qiáng)度和定位為內(nèi)對(duì)照,PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。選腫瘤細(xì)胞陽性染色集中區(qū)域,每張切片計(jì)

4、數(shù)400個(gè)癌細(xì)胞,由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測(cè)。Dvl判定標(biāo)準(zhǔn):我們將陽性細(xì)胞數(shù)<10％定為正常表達(dá)(negtive-),而將≥11％定為異常表達(dá)(positive+)。β-catenin判定標(biāo)準(zhǔn):正常上皮組織中陽性表達(dá)并定位于細(xì)胞膜,我們將膜陽性瘤細(xì)胞數(shù)≤90％定為膜表達(dá)降低,膜表達(dá)降低和胞漿出現(xiàn)陽性統(tǒng)歸為異常表達(dá)。p120ctn判定標(biāo)準(zhǔn):p120ctn正常表達(dá)定位于細(xì)胞膜,我們將膜表達(dá)細(xì)胞數(shù)<90％或胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒統(tǒng)歸為異常表達(dá)。

5、r>　　 3、RT-PCR
　　 采用TrizolTM試劑提取肺癌組織或培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA,利用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。分別擴(kuò)增Dvl-1、Dvl-3、p120ctn和β-catenin,以β-actin為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后,成像分析。
　　 4、Western Blot
　　 將含80μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜

6、,單克隆抗體Dvl-1,Dvl-3,β-catenin和p120ctn 4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育1h后DAB或ECL顯色。
　　 5、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 在37℃,含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人類肺癌細(xì)胞系LTEP-α-2和A549細(xì)胞系,培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清的RPMI 1640,貼壁生長,每2-3天胰酶消化傳代一次。
　　 6、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　 將含有目的基因的載體導(dǎo)入感受態(tài)

7、宿主細(xì)菌DH5α中擴(kuò)增、純化,測(cè)序驗(yàn)證后,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系LTEP-α-2和A549中培養(yǎng),通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效果。
　　 7、Dual-luciferase Asssay
　　 按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞種植于24孔板,并分別以pGL3-OT或pGL3-OF(0.5μg)報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)

8、染,共轉(zhuǎn)染內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK(50ng),37℃培養(yǎng)30hr。用雙螢光報(bào)告檢測(cè)試劑檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況,Tc價(jià)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示,螢光素酶活性數(shù)值分別以pRL-TK報(bào)告質(zhì)粒的海腎素活性校正。為分析Dvl對(duì)β-catenin的影響,共轉(zhuǎn)染pCS2-Myc-Dvl1或pMyc-cyto-Dvl3(0.5μg),并以空質(zhì)粒pCS2+或pMyc-cyto(0.5μg)控制質(zhì)粒量。
　　 8、體外

9、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力
　　 按照BD公司說明操作,取100μl細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)滴入上室內(nèi),下室加入含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開,將小室置37℃,5％CO2條件下放置后,棄去上室內(nèi)液體,擦盡膜上Matrigel膠,100％甲醇固定30分鐘,常規(guī)蘇木素染色,光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)分析
　　 各組資料利用SPSS for

10、 Window 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、正常支氣管上皮細(xì)胞的Dvl蛋白呈陰性表達(dá),而在肺癌組織中,Dvl-1、3均存在過表達(dá),陽性信號(hào)主要定位于胞漿,為彌漫分布。正常支氣管上皮細(xì)胞p120ctn、β-catenin表達(dá)為細(xì)胞膜陽性,而在肺癌組織中主要表現(xiàn)為膜表達(dá)減弱或出現(xiàn)胞質(zhì)異位表達(dá)。Dvl-1和Dvl-3在腺癌的陽性率均高于鱗癌,Dvl-1、Dvl-3過表達(dá)和β-cate

11、nin及p120ctn的異常表達(dá)均與NSCLC的低分化有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌,其Dvl-3的陽性率和β-catenin及p120ctn的異常表達(dá)率顯著高于未轉(zhuǎn)移者。在Ⅲ-Ⅳ期患者中,Dvl-1及Dvl-3的陽性率和p120ctn的異常表達(dá)率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期。
　　 2、肺癌組織中Dvl-1的過表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)相關(guān),而Dvl-3的過表達(dá)與p120ctn異常表達(dá)相關(guān),與β-catenin表達(dá)卻無相關(guān)性。
　　

12、 3、80例有完整隨訪資料的非小細(xì)胞肺癌,經(jīng)Log-rank檢驗(yàn),其Dvl-3及p120ctn正常表達(dá)者與異常表達(dá)者平均生存時(shí)間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Dvl-1過表達(dá)和β-catenin的異常表達(dá)與生存時(shí)間未發(fā)現(xiàn)有意義的差異。將各病理因素輸入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)Dvl-3過表達(dá)、p120ctn異常表達(dá)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　 4、選擇Dvl-2穩(wěn)定表達(dá),而Dvl-1和Dv

13、l-3低表達(dá)的A549和LTEP-α-2肺腺癌細(xì)胞系,分別轉(zhuǎn)染Dvl-1和Dvl-3,RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染前后β-catenin mRNA水平變化不明顯,但Western blotting結(jié)果與未轉(zhuǎn)染和空質(zhì)粒組對(duì)比顯示,轉(zhuǎn)染Dvl-1肺癌細(xì)胞系的β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào),而轉(zhuǎn)染Dvl-3肺癌細(xì)胞系的β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)。采用pGL3-OT/OF螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Dvl-1增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞β-catenin依賴

14、的Tcf轉(zhuǎn)錄活性,而過表達(dá)Dvl-3抑制肺腺癌細(xì)胞β-catenin依賴的Tcf轉(zhuǎn)錄活性。
　　 5、在A549和LTEP-α-2肺癌細(xì)胞中過表達(dá)Dvl-1、Dvl-3均使p120ctn蛋白表達(dá)增高。RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Dvl-1后,p120ctn mRNA變化不明顯,而轉(zhuǎn)染Dvl-3可明顯增高p120ctn mRNA水平。
　　 6、分別轉(zhuǎn)染Dvl-1和Dvl-3后,A549細(xì)胞及LTEP-α-2細(xì)胞侵襲至濾膜表

15、面的腫瘤細(xì)胞數(shù)均明顯高于空質(zhì)粒組。轉(zhuǎn)染Dvl-1并加入β-catenin抗體(100ng/ml)18h后,轉(zhuǎn)染Dvl-3并加入p120ctn抗體(100ng/ml)18h后,細(xì)胞對(duì)基質(zhì)膠的侵襲穿透能力均受到明顯抑制。而轉(zhuǎn)染Dvl-1并加入p120ctn抗體(100ng/ml)以及轉(zhuǎn)染Dvl-3并加入β-catenin抗體(100ng/ml),卻未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的侵襲能力有明顯的影響,因此Dvl-1通過β-catenin,而Dvl-3則可能通

16、過p120ctn增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞侵襲能力。
　　 結(jié)論
　　 1、肺癌中不僅存在著Dvl-1和Dvl-3的過表達(dá),而且其異常表達(dá)與NSCLC的分型、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。
　　 2、Dvl-1過表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)相關(guān),Dvl-3過表達(dá)與p120ctn異常表達(dá)及肺癌的不良預(yù)后正相關(guān),并可作為影響肺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 3、Dvl-1通過經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲能力