NAKED1的表達下調促進小細胞肺癌的侵襲并與不良預后相關.pdf

1、惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和致死率已經越來越高。目前已有文獻報道，Wnt通路的失調與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。Disheveled蛋白(Dv1)是Wnt信號通路中位于上游的一個效應分子，是經典Wnt/β-catenin通路、非經典Wnt(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路的重要調節(jié)因子。
　　 dNKD(Naked Cuticle Drosophila)首次被發(fā)現是在果蠅體內，其基因的突變能誘發(fā)果蠅分節(jié)運動的缺失。此后，NKD1和

2、NKD2作為哺乳動物體內Naked CuticleDrosophila的兩個同系物，也相繼被報道。NKD1和NKD2的基因分別位于人體染色體16q12.1和5p15.3。兩者在整個氨基酸序列上存有43.8％的高度同源。NKD1含有470個氨基酸序列，它在胞漿通過其EF-Hand區(qū)域與Dv1結合，從而抑制了經典的Wnt通路。有文獻報道，NKD抑制了經典的Wnt通路，卻激活了PCP通路，在信號轉導中發(fā)揮著重要的作用。有人在直腸腺癌和肝母細胞

3、瘤中發(fā)現，NKD1的mRNA水平要明顯高于正常組織。NKD1的基因是經典Wnt通路的下游靶基因之一，受經典通路的調控。在體內可能存在一種負反饋的機制調節(jié)著NKD1的水平。然而具體的機制不是很清楚。
　　 盡管有關NKD1是如何發(fā)揮生物學功能已有一些報道，但NKD1與腫瘤的關系目前報道較少。NKD1在NSCLC中的的表達及其與臨床病理因素之間的關系尚無文獻報道。本實驗檢測了非小細胞肺癌中NKD1的表達情況及其臨床意義，并在肺癌細胞

4、系中干擾了NKD1的表達，觀察對肺癌細胞系侵襲能力的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、患者信息和樣本
　　 100例非小細胞肺癌標本來自中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院病理科存檔蠟塊。術前均未接受化療或放射治療?；颊叩钠骄挲g是58歲。根據WHO組織學分類標準，腺癌67例，鱗癌33例。根據2009年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準，Ⅰ期24例，Ⅱ期20例，Ⅲ期44例，Ⅳ期12例。另外還有66例具有完整的隨訪資料。

5、>　　 另收集35對新鮮的肺癌組織及相對應的周圍正常的肺組織，保存在-70℃箱內，用于提取蛋白質和RNA。
　　 二、免疫組織化學
　　 所有的組織塊經中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫組化法進行染色。一抗使用兔源性的NKD1(1:100，santa cruz biotechnology)抗體4℃孵育過夜。以PBS代替一抗作為陰性對照。生物素標記的二抗37℃孵育30分鐘，DAB顯色。
　

6、　 三、免疫組化結果判定標準
　　 每張切片×400倍下隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞。根據著色細胞的百分比，NKD1的表達被劃分成五個等級：0分（無著色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根據細胞著色的強度，NKD1的表達又被劃分成3個等級：0分（無著色），1分（淺黃色顆粒），2分（深黃色或者黃褐色顆粒）。每一張組織切片都對應一個百分比分數和著色分數，將二者相

7、乘，所得的乘積即為該切片的最終得分。
　　 根據35例正常的支氣管上皮染色后，其得分均大于3分。據此，我們將大于或者等于3分的計為正常表達，而小于3分的計為低表達。
　　 四、RT-PCR和Real-TimePCR
　　 細胞或者剪碎的組織利用Trizol試劑(Invitrogen)裂解，然后按照說明書的步驟，提取總的RNA。我們使用AMVVer3.0(Takara，Shiga, Japan)試劑盒。PCR產物通

8、過2％的瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Imaging System進行灰度值測定，以MMP7/β-Actin作為相對表達量。Real-Time PCR實驗的引物有Takara生物制劑公司設計合成，使用SYBR Green試劑盒，以β-Actin作為內參。并用Stratagene MxPro軟件分析RNA的相對表達量。
　　 五、免疫印跡分析
　　 組織或細胞采用RIPA裂解液進行充分裂解，然后提取總蛋白，取100微克的總蛋

9、白通過10％濃度的SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，然后轉印到PVDF膜上。1％脫脂奶粉封閉2小時，一抗NKDⅠ(1:200，Santa Cruz)，NKDⅡ(1:500，Cell Signaling)，β-Actin(1：500)4°過夜。山羊抗兔二抗37℃孵育2小時。ECL發(fā)光后，Bio-Image system進行條帶灰度值測定，以NKD1/β-Actin的比值作為相對表達量。實驗重復三次進行。
　　 六、細胞培養(yǎng)和轉染<

10、br>　　 HBE細胞系從中科院細胞庫獲得。LH7和BE1是來自zhengjie教授的友好惠贈。肺鱗癌LK和腺癌LTEP購自美國生物學公司。細胞系均用含有10％小牛血清和100U/mL青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并將其置于5％濃度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 細胞接種在24孔板內，24小時候后以60ng/mL的NKD1 siRNA(SC-93414，購買于santa cruz公司)，采用Lipo2000(Invitrog

11、en，Carlsbad，CA)脂質體介導的方法進行轉染，轉染48小時后進行檢測。
　　 七、細胞基質膠侵襲實驗
　　 以雙無的1640培養(yǎng)基按照1：3的比例稀釋基質膠(BD Biosciences)，鋪在8微米孔徑的上室。以100微升含有5×105個的細胞密度接種在上室。下室放含有10％小牛血清的培養(yǎng)基。種植后培養(yǎng)48小時后，甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機選取10個視野，計數侵襲到小室下的細胞數。實驗重復三次，取均值

12、。
　　 八、統(tǒng)計學分析
　　 所有的數據采用SPSS13.0版本進行統(tǒng)計學分析。采用Chis-Square檢驗NKD1表達與臨床病理因素之間的關聯(lián)。采用t檢驗檢測Westem Blot和RT-PCR結果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法檢測NKD1對患者生存時間的影響。Cox回歸模型用以研究不同的變量對患者生存的影響。P＜0.05作為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、肺癌組織中NKD1蛋白

13、表達下調，而mRNA表達上調
　　 我們從35對肺癌及癌旁正常的肺組織中提取的總蛋白，Western Blot檢測結果發(fā)現，肺癌中NKD1的蛋白水平要明顯低于周圍肺組織(P=0.009)。
　　 接著我們在三種細胞系中進一步進行了驗證。結果顯示，正常的支氣管上皮細胞系HBE的NKD1蛋白表達量明顯高于兩種肺癌細胞系BE1（侵襲力較高的）和LH7(侵襲能力相對低一些)，并且高侵襲力的BE1比LH7中的NKD1蛋白水平更低。

14、
　　 細胞系中的結果提示我們，NKD1蛋白的表達水平可能與肺癌細胞的侵襲能力有關。但Real-Time PCR的檢測結果卻表明，NKD1mRNA在肺癌中的表達量要明顯高于癌旁正常肺組織，并且我們在三種細胞系中也得到了同樣的結果。
　　 2、NKD1蛋白的表達下調與肺癌的臨床病理因素和不良預后相關
　　 我們將35例正常的支氣管上皮組織切片進行染色，免疫組化評估結果顯示，其得分值均大于或者等于3分，將其作為正常表

15、達。然而，在100例非小細胞肺癌的組化結果中，有78例(78％)的表現為低表達，22例(22％)為正常表達。
　　 我們采用了SPSS軟件分析了低表達的NKD1和肺癌的臨床病理因素之間的聯(lián)系，結果發(fā)現：低表達的NKD1與肺癌的組織類型(P=0.003)，低分化(P=0.004)，高TNM分期(P=0.002)，淋巴結轉(P=0.013)相關，采用Kaplan-Meier生存分析也發(fā)現NKD1低表達的肺癌患者其預后生存時間要明顯低

16、于正常表達的肺癌患者(P=0.03)。并且Cox風險模型分析結果表明，NKD1蛋白是影響肺癌患者預后的一個危險因素之一(P=0.017)。
　　 3、NKD1的蛋白下調可以上調Dishevelled-1,β-Catenin的蛋白表達，并增強了MMP-7基因的轉錄和肺癌細胞系的侵襲能力
　　 采用siRNA技術下調NKD1的蛋白表達后，發(fā)現肺癌細胞系中Dishevelled-1和β-Catenin的蛋白水平隨之上調。為了檢

17、測NKD1對肺癌細胞系侵襲能力的影響，下調NKD1的蛋白表達后，進行基質膠侵襲實驗，結果發(fā)現：干擾NKD1后，肺癌細胞系LTEP和LK的侵襲能力均增強。然而干擾的同時孵育Dishevelled-1的特異性抗體后，細胞的侵襲能力發(fā)生了下調。
　　 緊接著，我們檢測了經典的Wnt信號通路下游靶基因MMP-7的轉錄水平，結果發(fā)現：下調NKD1的蛋白表達后，MMP-7基因的轉錄水平增加，并且這一上調受Dishevelled-1的影響。<