p120ctn對Kaiso的調控及兩者在肺癌中作用的研究.pdf

1、作為Armadillo蛋白亞家族中的重要成員之一的p120-catenin(p120ctn)一直被認為是E—cadherin/catenin黏附復合物的重要調節(jié)因子。同時，p120ctn也是小GTP酶的重要調節(jié)因子，它可以在細胞漿中通過調節(jié)小GTP酶的活性狀態(tài)來調控細胞骨架的裝配，它在細胞黏附以及腫瘤侵襲和轉移方面的作用已經受到人們的廣泛重視。大量研究表明，p120ctn的異常表達與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移密切相關。隨著研究的深入，特別是

2、核轉錄因子Kaiso的發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)p120ctn還可以作為一種信號分子穿梭于核/漿之間，通過影響核轉錄因子Kaiso調控基因表達。 本研究目的旨在探討肺癌組織中p120ctn和Kaiso的表達情況及與臨床病理學參數(shù)意義、肺癌患者預后的關系。在細胞水平上，應用shRNA干擾技術研究Kaiso的核內功能，通過穩(wěn)定干擾和過表達p120ctn的表達，分析p120ctn亞型蛋白1和3對Kaiso表達和定位的影響。運用細胞周期同步化技術探

3、討細胞周期對Kaiso核漿分布的影響。 方法： 1、肺癌組織 原發(fā)性肺癌標本及配對的淋巴結轉移癌均來自中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院外科1998—2005年手術切除的標本。所有患者術前均未接受放、化療。其中部分患者保存有完整、詳實的預后資料。標本經4％中性甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色后明確診斷。其中部分癌旁肺組織(遠離腫瘤至少5厘米)和淋巴結轉移癌離體后立即放入液氮后—70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2、免疫組織化學

4、染色及結果判定 標本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白—過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測Kaiso和p120ctn蛋白表達。單克隆抗體Kaiso和p120ctn4℃孵育過夜。以癌旁肺支氣管粘膜上皮細胞著色強度和定位為內對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。結果判定：高倍視野(×400)下選陽性信號最強區(qū)域計數(shù)200個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù)，按Kaiso表達百分率分為以

5、下四個等級：<25％為0分，26％—50％為1分，51％—75％為2分，>75％為3分。根據(jù)免疫組化染色強度分為三個等級：淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分，積分為0和1分者判定為陰性，積分>2為陽性。當Kaiso核陽性信號≥5％時定為核陽性表達。P120ctn正常表達的陽性信號定位于細胞膜，表現(xiàn)為膜著色清楚、連續(xù)且陽性細胞數(shù)≥90％；膜表達下降表現(xiàn)為膜著色淡且不連續(xù)，陽性細

6、胞數(shù)<90％；而超過10％的腫瘤細胞胞漿出現(xiàn)陽性信號定為異位表達。P120ctn的異位表達和膜表達下降統(tǒng)歸為p120ctn異常表達。 3、間接免疫熒光檢測 固定后的冰凍組織切片和細胞爬片用0.2％ Triton X—100處理15分鐘，非免疫動物血清封閉，一抗為單克隆抗體小鼠抗人Kaiso和小鼠抗人p120ctn4℃孵育過夜；二抗為異硫氰酸熒光素(FITC)標記或羅丹明標記(TRITC)標記的山羊抗小鼠IgG，碘化丙啶或

7、DAPI進行核復染。50％緩沖甘油封片，熒光顯微鏡OlympusⅨ51于波長為527nm處觀察羅丹明熒光強度，于372nm波長處觀察DAPI的熒光染色觀察并照相。陰性對照實驗：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。 4. Western Blot 將含80μg總蛋白的裂解產物進行SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，單克隆抗體Kaiso或p120ctn4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育2小時后DAB

8、或ECL顯色。 5、RT-PCR 采用TrizolTM試劑提取肺癌組織或培養(yǎng)細胞的總RNA，利用RNA PCR Kit(AMV) Ver．3.0試劑盒進行反轉錄。分別擴增Kaiso、p120ctn和matrilysin，以β—actin為內參。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析。 6、細胞培養(yǎng) 在37℃，含5％ CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)人類肺癌細胞系BE1、SPC—A—1、LTEP—A—2和A549

9、細胞系，培養(yǎng)基分別為含10％滅活胎牛血清的RPMI1640或高糖DMEM，貼壁生長，每2—3天胰酶消化傳代一次。 7、質粒構建與轉染 shRNA干擾質粒導入感受態(tài)宿主細菌E.coli中擴增、純化，使用Arrest—InTMTransfection Reagent轉染試劑將質粒分別轉染至肺癌細胞系LTEP—A—2、SPC—A—1和BE1中，通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉染效果。 將含有目的基因的

10、載體導入感受態(tài)宿主細菌DH5α中擴增、純化，測序驗證后，使用Lipofect2000轉染試劑將質粒分別轉染至肺癌細胞系A549中，并以G418篩選出陽性細胞克隆，通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉染效果后，挑取轉染成功的單克隆細胞在含有G418的RPMI1640或高糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。 8、體外基質膠侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 按照BD公司說明操作，取100μl細胞懸液(5×106個/ml)滴入上室內

11、，下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開，將小室置37℃，5％CO2條件下放置后，棄去上室內液體，擦盡膜上Matrigel膠，100％甲醇固定30分鐘，常規(guī)蘇木素染色，光鏡下計數(shù)細胞數(shù)。 9、四甲基偶氮唑鹽(tetrazolium，MTT)法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的肺癌細胞懸液(細胞密度3×105個/ml)分別接種于4個96孔板培養(yǎng)板，每板分6組：空白組

12、(A)(B)，干擾對照組(C)、干擾組(D)、抗體抑制對照組(E)和抗體移植組(F)。培養(yǎng)第24、48、72小時分別加入MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)孵育4小時后，每孔加入150μlDMSO溶解結晶，選擇波長490nm，在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實驗重復3次。繪制細胞生長曲線。 10、核漿蛋白分離 按照Thermo公司說明操作，取一定體積(100mg)的組織或者10× l06的細胞，依次加入體

13、積比為200：11:100的試劑CERⅠ，CERⅡ和NER，分別提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白。檢測α-Tubulin和Lamin B1在兩種細胞組分中的表達以驗證核漿蛋白分離效果。 11、免疫共沉淀 提取的蛋白中加入4μg的誘餌蛋白抗體，充分混勻后4℃孵育2小時后加入25μl Protein G Microbeads，混勻后繼續(xù)4℃孵育1小時。按照操作說明步驟，混合液過μ柱，SDS上樣緩沖液沖洗μ柱，收集免疫共沉淀產物。

14、 12、細胞周期同步化 G0期同步化(血清饑餓法)：指數(shù)生長期的肺癌細胞，培養(yǎng)至匯合密度為30％時收集細胞，1000rpm離心5分鐘，PBS洗2次后鋪板接種，換成無血清的RPMI—1640/DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36小時后用于檢測。 S期同步化(胸苷雙阻斷法)：指數(shù)生長期的肺癌細胞，培養(yǎng)液中加入胸苷至終濃度2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)18小時。以1000rpm離心5小時，棄上清，用PBS清洗3次，去除胸苷阻滯。將

15、細胞重新懸浮成細胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)液中再加入胸苷，使之終濃度為2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，換新鮮培養(yǎng)液，1000rpm離心，預熱Hanks液清洗2次后接種入另一培養(yǎng)瓶內，繼續(xù)培養(yǎng)2小時后用于檢測。 13、流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數(shù)生長期細胞制成1×107個/ml細胞懸液。取1ml細胞懸液75％冷乙醇于4℃固定、離心后制成500μl的細胞懸液，加碘化丙啶

16、染液于4℃孵育45分鐘后上機檢測，ModFitLT3.0軟件分析細胞周期。 14、統(tǒng)計分析 各組資料利用SPSS for Window13.0進行統(tǒng)計分析。P<0.05有統(tǒng)計學意義。 結論： 1、Kaiso在細胞漿和細胞核中的生物學作用不同。 肺癌組織中Kaiso的表達量明顯高于癌旁肺組織，Kaiso的漿陽性表達與肺癌的分期、淋巴結轉移、不良預后密切相關，可能是影響肺癌不良預后的獨立危險因素。Ka

17、iso在細胞核內抑制著matrilysin基因的轉錄，下調Kaiso的核表達使肺癌的增殖和侵襲能力顯著上調。 2、p120ctn和Kaiso在肺癌中協(xié)同表達，p120ctn調控著Kaiso的蛋白表達量和核漿分布。 P120ctn與Kaiso在肺癌組織中協(xié)同漿表達，在肺癌原發(fā)灶及淋巴結轉移癌中均能檢測到Kaiso-P120ctn復合物。P120ctn亞型1和亞型3都可以影響Kaiso的蛋白表達量，但不影響Kaiso的轉錄