二價(jià)雙啟動(dòng)子防齲DNA疫苗pCN-SSISG的構(gòu)建及其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、背景與目的：齲病是一種發(fā)病率很高的疾病，現(xiàn)代病因?qū)W認(rèn)為齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，其發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中牙菌斑在牙面的形成是齲病發(fā)生的先決條件。大量的研究表明在牙菌斑的形成及致齲過程中變形鏈球菌起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是主要的致齲菌。變形鏈球菌在牙面的粘附、聚集是其致齲作用首要的和關(guān)鍵的一步，也是最為重要的一步。因此通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫的方法來封閉、失活變形鏈球菌菌體表面參與粘附和聚集的毒力因子，阻止變形鏈球菌在牙面的粘附聚集從而降低

2、其致齲力，一直是齲病免疫預(yù)防研究的焦點(diǎn)。近年來，隨著基因治療的飛速發(fā)展，防齲DNA疫苗的研究也成為齲病防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在前期的研究中已經(jīng)成功地構(gòu)建了載有與變形鏈球菌最初附著有關(guān)的表面蛋白抗原AgI/II的唾液結(jié)合區(qū)段(SBR)基因的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCN-SSIE(含真核啟動(dòng)子CMV和原核啟動(dòng)子Nir)，和載有變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶葡聚糖結(jié)合區(qū)(GBR)基因的表達(dá)載體pTriEx-4-GBR，且證實(shí)了它們的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建載

3、有SBR和GBR基因的二價(jià)雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCN-SSISG。并檢測(cè)其在原核細(xì)胞減毒沙門氏菌SL3261中的表達(dá)情況以及以減毒沙門氏菌為DNA疫苗載體通過口服在動(dòng)物小鼠體內(nèi)免疫的情況。 方法：根據(jù)GenBank公布的S.mutans glucosyltransferase(gtfB and gtfC)genes基因序列(序列號(hào)M17361)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物5’端含有限制性內(nèi)切酶HindIII位點(diǎn)；下游引物5’端含有X

4、hoI的酶切位點(diǎn)。利用PCR技術(shù)從載有變形鏈球菌gtfB基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增葡聚糖結(jié)合區(qū)段(GBR)的基因片段，然后將合成的組織纖溶酶原信號(hào)肽序列(tPA-SP)連接到GBR基因的上游，再將此基因(sGBR)定向克隆到載有sSBR基因的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCN-SSIE上，構(gòu)建出pCN-SSISG。通過酶切分析和DNA測(cè)序證明雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pCN-SSISG構(gòu)建成功后，再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL3261，并用轉(zhuǎn)化子口服免疫小鼠；同時(shí)利用

5、在前期研究中已構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pTriEx-4-SBR和pTriEx-4-GBR在大腸桿菌JM109(DE3)中分別誘導(dǎo)表達(dá)抗原蛋白SBR和GBR，并應(yīng)用HisTrapTM蛋白純化試劑盒純化后，皮下免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EIASA)和Westemblotting檢測(cè)pCN-SSISG在原核細(xì)胞減毒沙門氏菌SL3261中表達(dá)SBR和GBR蛋白的情況，和以減毒沙門氏菌為載體在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的全身及粘膜免疫反

6、應(yīng)情況。 結(jié)果：通過對(duì)重組質(zhì)粒pCN-SSISG的酶切鑒定以及DNA序列測(cè)定分析，證明重組表達(dá)載體pCN-SSISG構(gòu)建成功、開放閱讀框架正確；SDS-PAGE表明在減毒沙門氏菌SL3261中pCN-SSISG能正常表達(dá)目的蛋白，其條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符，Western blot也檢測(cè)到了SBR和GBR蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明質(zhì)?？梢栽谠思?xì)胞中正常工作。同時(shí)用ELISA間接法和Western blotting檢測(cè)口服免疫小鼠的

7、血清抗體，結(jié)果顯示制備的小鼠血清能特異地結(jié)合在原核細(xì)胞中表達(dá)及純化的SBR和GBR融合蛋白，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)結(jié)果顯示：在以減毒沙門氏菌為載體口服免疫的小鼠血清及唾液中，都檢測(cè)到了明顯高于對(duì)照組的高水平的抗SBR和GBR特異性抗體IgG、IgA。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用PCR、T-A克隆等分子生物學(xué)技術(shù)成功地將編碼SBR及GBR的基因定向克隆到表達(dá)載體pCMVnir上，構(gòu)建出了一個(gè)新韻特別適合以減毒沙門氏菌為載體的二價(jià)雙啟