HBV不同組分下調(diào)肝癌細(xì)胞MICA-B的表達(dá)從而逃逸NK細(xì)胞殺傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 肝癌在全世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤發(fā)病的第五位。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，HBV攜帶者較非攜帶者發(fā)生肝癌(HCC)的危險(xiǎn)率高10倍，因而HBV感染是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要因素。HBV基因組由HBx、HBc、HBs和HBp四部分組成，它們在HBV復(fù)制中所發(fā)揮的作用已研究的較為清楚，但它們對HBV+肝癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響和機(jī)制尚不清楚。在HBV感染過程中，NK細(xì)胞對于HBV病毒的清除起了重要作用。NK細(xì)胞可通過釋放IFN-γ和TN

2、F-α等多種細(xì)胞因子殺傷HBV感染的肝細(xì)胞，同時(shí)NK細(xì)胞表面表達(dá)多種受體，可通過與靶細(xì)胞表面的配體結(jié)合啟動(dòng)殺傷信號。有研究報(bào)道，HBV感染機(jī)體后，導(dǎo)致機(jī)體NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp46表達(dá)的降低，并且其分泌IFN-γ和TNF-α細(xì)胞因子的能力顯著降低。此外，感染HBV的肝細(xì)胞表面活化性配體如MICA/B表達(dá)下降，并且免疫負(fù)調(diào)因子如IL-10和TGF-β分泌顯著增加。為探討HBV感染過程中HBV的哪些組分參與調(diào)控了肝

3、細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，本課題分別構(gòu)建了含有HBV各組分的表達(dá)載體，將它們轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞后，觀察HBV的哪個(gè)或哪幾個(gè)組分可以影響HepG2細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)，并從兩個(gè)方面探討了HBV組分影響MICA/B表達(dá)的機(jī)制。第一，在轉(zhuǎn)錄水平上，預(yù)測并驗(yàn)證參與調(diào)控MICA/B的新轉(zhuǎn)錄因子，觀察新的轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)節(jié)MICA/B的表達(dá)以及HBV各組分對這些轉(zhuǎn)錄因子的影響。另外，從已知的調(diào)控MICA/B的轉(zhuǎn)錄因子S

4、TAT3著手，驗(yàn)證STAT3作為抑制性轉(zhuǎn)錄因子的作用。第二，檢測與MICA/B相關(guān)的miRNAs的變化，通過miRNAs過表達(dá)及抑制實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察HBV各組分是否通過影響miRNAs的表達(dá)而對HepG2細(xì)胞MICA/B的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　 方法：
　　 1、以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15為研究對象，利用MTT和CFSE/7AAD法檢測NK92細(xì)胞對其的殺傷敏感性，利用FACS技術(shù)檢測上述細(xì)胞表

5、面殺傷相關(guān)配體的表達(dá)。
　　 2、構(gòu)建pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡和RT-PCR方法驗(yàn)證上述質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，并且可穩(wěn)定表達(dá)。用MTT和CFSE/7AAD法檢測NK92細(xì)胞對轉(zhuǎn)染了不同質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的殺傷敏感性的變化。
　　 3、利用Q-PCR和FACS技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染HBV各組分后，HepG2細(xì)胞表面MI

6、CA/B、ULBPs和Fas的表達(dá)。
　　 4、以siRNA沉默HepG2.2.15細(xì)胞HBx和HBc后，利用Q-PCR和FACS技術(shù)檢測MICA/B的表達(dá)。
　　 5、在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBV各組分后，利用螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測MICA/B啟動(dòng)子的活性;通過網(wǎng)站預(yù)測出可能調(diào)節(jié)MICA/B表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和GATA-3;轉(zhuǎn)染HBV各組分后，Q-PCR檢測GATA-2和GATA-3的變化;利用RNAi技術(shù)沉

7、默HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞GATA-2和GATA-3的表達(dá)，進(jìn)而用RT-PCR和FACS技術(shù)檢測MICA/B的表達(dá)。
　　 6、沉默HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中GATA-2和GATA-3后，螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測MICA/B啟動(dòng)子活性的變化。
　　 7、WestemBlot檢測HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中GATA-2和GATA-3的表達(dá)，染色質(zhì)免疫共沉淀檢測GATA-2和GATA-3與H

8、epG2和HepG2.2.15細(xì)胞中MICA啟動(dòng)子的結(jié)合，免疫共沉淀檢測HBx蛋白是否與GATA-2和GATA-3結(jié)合。染色質(zhì)免疫共沉淀檢測HepG2.2.15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBx-siRNA后，MICA啟動(dòng)子與GATA-2和GATA-3結(jié)合區(qū)域的表達(dá)。
　　 8、在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBV各組分后，Q-PCR技術(shù)檢測miRNA20a、miRNA93和miR106b的變化;在過表達(dá)HBV不同組分的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染miRNA106b的i

9、nhibitor，利用FACS技術(shù)檢測HepG2細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)的變化。
　　 9、HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV各組分后，WesternBlot技術(shù)檢測STAT3的表達(dá);在轉(zhuǎn)染HBV各組分的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行STAT3-decoy轉(zhuǎn)染以阻斷STAT3與靶基因的結(jié)合，并用FACS技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、與HepG2細(xì)胞相比，HBV+的HepG2細(xì)胞對NK92細(xì)胞殺傷敏感性降

10、低。HBV+的HepG2細(xì)胞表面的活化性配體MICA/B和ULBPs的表達(dá)降低，抑制性配體HLA-ABC基本不變，PD-L1的表達(dá)升高，而死亡受體Fas表達(dá)降低。
　　 2、構(gòu)建的pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞后可穩(wěn)定表達(dá)。
　　 3、與轉(zhuǎn)染HBs和HBp基因的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBx和HBc的HepG2細(xì)胞對NK92細(xì)胞的殺傷敏感性顯著

11、降低。
　　 4、轉(zhuǎn)染HBx和HBc后，HepG2細(xì)胞表面MICA/B下降更為明顯，轉(zhuǎn)染HBx的HepG2細(xì)胞表面ULBP2明顯下降，轉(zhuǎn)染HBx和HBp的HepG2細(xì)胞Fas下降明顯。
　　 5、在HepG2.2.15細(xì)胞中沉默HBx或者HBc后，其細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)升高。
　　 6、轉(zhuǎn)染HBx和HBc可明顯促進(jìn)MICA/B啟動(dòng)子活性及GATA-2和GATA-3的表達(dá)升高。HepG2和HepG2.2.15細(xì)

12、胞中轉(zhuǎn)染GATA-2和GATA-3的siRNA降低GATA-2和GATA-3的表達(dá)，則MICA/B的表達(dá)和MICA/B啟動(dòng)子活性明顯增加。
　　 7、與HepG2細(xì)胞相比，HepG2.2.15細(xì)胞中GATA-2和GATA-3的表達(dá)較高。HepG2.2.15細(xì)胞中GATA-2和GATA-3與MICA啟動(dòng)子結(jié)合更多，HBx蛋白可與GATA-2或GATA-3結(jié)合。用HBx-siRNA沉默HBx后，GATA-2或GATA-3與MICA啟

13、動(dòng)子的結(jié)合明顯減少。
　　 8、轉(zhuǎn)染HBV各組分后，靶向MICA/B的miRNA20a、miRNA93和miR106b的表達(dá)水平有不同程度的增加;在HepG2中轉(zhuǎn)染HBV各組分后再轉(zhuǎn)染miRNA106b的inhibitor，則HBx和HBc引起的MICA/B的變化可被削弱。
　　 9、轉(zhuǎn)染HBx和HBc可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞STAT3的活化，加入decoy阻斷STAT3信號通路后，則HBx和HBc引起的MICA/B的變

14、化可被削弱。
　　 結(jié)論：
　　 1、HBV+的肝癌細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯低于HBV-的肝癌細(xì)胞。
　　 2、HBx和HBc可下調(diào)HepG2細(xì)胞中MICA/B的表達(dá)，從而減低NK細(xì)胞對其殺傷敏感性。
　　 3、發(fā)現(xiàn)GATA-2和GATA-3可以結(jié)合在MICA/B的啟動(dòng)子區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制MICA/B的表達(dá)。
　　 4、發(fā)現(xiàn)HBV可促進(jìn)GATA-2和GATA-3的表達(dá)，HBx蛋白可與GA