HBV不同組分下調(diào)肝癌細胞MICA-B的表達從而逃逸NK細胞殺傷的機制研究.pdf

1、目的：
　　 肝癌在全世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤發(fā)病的第五位。流行病學調(diào)查結果顯示，HBV攜帶者較非攜帶者發(fā)生肝癌(HCC)的危險率高10倍，因而HBV感染是導致肝癌發(fā)生的主要因素。HBV基因組由HBx、HBc、HBs和HBp四部分組成，它們在HBV復制中所發(fā)揮的作用已研究的較為清楚，但它們對HBV+肝癌細胞生物學表型的影響和機制尚不清楚。在HBV感染過程中，NK細胞對于HBV病毒的清除起了重要作用。NK細胞可通過釋放IFN-γ和TN

2、F-α等多種細胞因子殺傷HBV感染的肝細胞，同時NK細胞表面表達多種受體，可通過與靶細胞表面的配體結合啟動殺傷信號。有研究報道，HBV感染機體后，導致機體NK細胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp46表達的降低，并且其分泌IFN-γ和TNF-α細胞因子的能力顯著降低。此外，感染HBV的肝細胞表面活化性配體如MICA/B表達下降，并且免疫負調(diào)因子如IL-10和TGF-β分泌顯著增加。為探討HBV感染過程中HBV的哪些組分參與調(diào)控了肝

3、細胞表面NKG2D配體的表達及其調(diào)控機制，本課題分別構建了含有HBV各組分的表達載體，將它們轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系HepG2細胞后，觀察HBV的哪個或哪幾個組分可以影響HepG2細胞表面MICA/B表達，并從兩個方面探討了HBV組分影響MICA/B表達的機制。第一，在轉(zhuǎn)錄水平上，預測并驗證參與調(diào)控MICA/B的新轉(zhuǎn)錄因子，觀察新的轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)節(jié)MICA/B的表達以及HBV各組分對這些轉(zhuǎn)錄因子的影響。另外，從已知的調(diào)控MICA/B的轉(zhuǎn)錄因子S

4、TAT3著手，驗證STAT3作為抑制性轉(zhuǎn)錄因子的作用。第二，檢測與MICA/B相關的miRNAs的變化，通過miRNAs過表達及抑制實驗，進一步觀察HBV各組分是否通過影響miRNAs的表達而對HepG2細胞MICA/B的表達進行調(diào)節(jié)。
　　 方法：
　　 1、以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15為研究對象，利用MTT和CFSE/7AAD法檢測NK92細胞對其的殺傷敏感性，利用FACS技術檢測上述細胞表

5、面殺傷相關配體的表達。
　　 2、構建pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表達載體，轉(zhuǎn)染至HepG2細胞后，通過熒光顯微鏡和RT-PCR方法驗證上述質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)入HepG2細胞，并且可穩(wěn)定表達。用MTT和CFSE/7AAD法檢測NK92細胞對轉(zhuǎn)染了不同質(zhì)粒的HepG2細胞的殺傷敏感性的變化。
　　 3、利用Q-PCR和FACS技術，檢測轉(zhuǎn)染HBV各組分后，HepG2細胞表面MI

6、CA/B、ULBPs和Fas的表達。
　　 4、以siRNA沉默HepG2.2.15細胞HBx和HBc后，利用Q-PCR和FACS技術檢測MICA/B的表達。
　　 5、在HepG2細胞中轉(zhuǎn)染HBV各組分后，利用螢光素酶報告基因技術檢測MICA/B啟動子的活性;通過網(wǎng)站預測出可能調(diào)節(jié)MICA/B表達的轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和GATA-3;轉(zhuǎn)染HBV各組分后，Q-PCR檢測GATA-2和GATA-3的變化;利用RNAi技術沉

7、默HepG2和HepG2.2.15細胞GATA-2和GATA-3的表達，進而用RT-PCR和FACS技術檢測MICA/B的表達。
　　 6、沉默HepG2和HepG2.2.15細胞中GATA-2和GATA-3后，螢光素酶報告基因技術檢測MICA/B啟動子活性的變化。
　　 7、WestemBlot檢測HepG2和HepG2.2.15細胞中GATA-2和GATA-3的表達，染色質(zhì)免疫共沉淀檢測GATA-2和GATA-3與H

8、epG2和HepG2.2.15細胞中MICA啟動子的結合，免疫共沉淀檢測HBx蛋白是否與GATA-2和GATA-3結合。染色質(zhì)免疫共沉淀檢測HepG2.2.15細胞中轉(zhuǎn)染HBx-siRNA后，MICA啟動子與GATA-2和GATA-3結合區(qū)域的表達。
　　 8、在HepG2細胞中轉(zhuǎn)染HBV各組分后，Q-PCR技術檢測miRNA20a、miRNA93和miR106b的變化;在過表達HBV不同組分的基礎上，轉(zhuǎn)染miRNA106b的i

9、nhibitor，利用FACS技術檢測HepG2細胞表面MICA/B表達的變化。
　　 9、HepG2細胞轉(zhuǎn)染HBV各組分后，WesternBlot技術檢測STAT3的表達;在轉(zhuǎn)染HBV各組分的基礎上，再進行STAT3-decoy轉(zhuǎn)染以阻斷STAT3與靶基因的結合，并用FACS技術檢測肝癌細胞表面MICA/B的表達。
　　 結果：
　　 1、與HepG2細胞相比，HBV+的HepG2細胞對NK92細胞殺傷敏感性降

10、低。HBV+的HepG2細胞表面的活化性配體MICA/B和ULBPs的表達降低，抑制性配體HLA-ABC基本不變，PD-L1的表達升高，而死亡受體Fas表達降低。
　　 2、構建的pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表達載體轉(zhuǎn)染到HepG2細胞后可穩(wěn)定表達。
　　 3、與轉(zhuǎn)染HBs和HBp基因的HepG2細胞相比，轉(zhuǎn)染HBx和HBc的HepG2細胞對NK92細胞的殺傷敏感性顯著

11、降低。
　　 4、轉(zhuǎn)染HBx和HBc后，HepG2細胞表面MICA/B下降更為明顯，轉(zhuǎn)染HBx的HepG2細胞表面ULBP2明顯下降，轉(zhuǎn)染HBx和HBp的HepG2細胞Fas下降明顯。
　　 5、在HepG2.2.15細胞中沉默HBx或者HBc后，其細胞表面MICA/B表達升高。
　　 6、轉(zhuǎn)染HBx和HBc可明顯促進MICA/B啟動子活性及GATA-2和GATA-3的表達升高。HepG2和HepG2.2.15細

12、胞中轉(zhuǎn)染GATA-2和GATA-3的siRNA降低GATA-2和GATA-3的表達，則MICA/B的表達和MICA/B啟動子活性明顯增加。
　　 7、與HepG2細胞相比，HepG2.2.15細胞中GATA-2和GATA-3的表達較高。HepG2.2.15細胞中GATA-2和GATA-3與MICA啟動子結合更多，HBx蛋白可與GATA-2或GATA-3結合。用HBx-siRNA沉默HBx后，GATA-2或GATA-3與MICA啟

13、動子的結合明顯減少。
　　 8、轉(zhuǎn)染HBV各組分后，靶向MICA/B的miRNA20a、miRNA93和miR106b的表達水平有不同程度的增加;在HepG2中轉(zhuǎn)染HBV各組分后再轉(zhuǎn)染miRNA106b的inhibitor，則HBx和HBc引起的MICA/B的變化可被削弱。
　　 9、轉(zhuǎn)染HBx和HBc可明顯促進HepG2細胞STAT3的活化，加入decoy阻斷STAT3信號通路后，則HBx和HBc引起的MICA/B的變

14、化可被削弱。
　　 結論：
　　 1、HBV+的肝癌細胞對NK細胞殺傷的敏感性明顯低于HBV-的肝癌細胞。
　　 2、HBx和HBc可下調(diào)HepG2細胞中MICA/B的表達，從而減低NK細胞對其殺傷敏感性。
　　 3、發(fā)現(xiàn)GATA-2和GATA-3可以結合在MICA/B的啟動子區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制MICA/B的表達。
　　 4、發(fā)現(xiàn)HBV可促進GATA-2和GATA-3的表達，HBx蛋白可與GA