應(yīng)用超聲造影評(píng)價(jià)肝纖維化的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟彌漫性病變發(fā)展為肝硬化的中間過程和重要階段，是細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解不平衡的結(jié)果，HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，檢測(cè)其血清學(xué)水平對(duì)肝纖維化診斷有參考價(jià)值。應(yīng)用影像學(xué)方法無創(chuàng)性評(píng)價(jià)肝纖維化一直是研究的熱點(diǎn)，但肝纖維化各期、乃至早期肝硬化缺乏特異性影像學(xué)表現(xiàn)。許多學(xué)者應(yīng)用Doppler超聲測(cè)量肝動(dòng)脈、門靜脈、肝靜脈血流量或血流速度、阻力指數(shù)等評(píng)價(jià)肝纖維化或肝硬化，結(jié)果存在一定爭(zhēng)議。 有學(xué)者利用微泡

2、聲學(xué)造影劑能夠增強(qiáng)Doppler信號(hào)的特點(diǎn)，建立了診斷肝硬化的新方法，但對(duì)于肝纖維化階段的評(píng)價(jià)作用尚有爭(zhēng)議，另外應(yīng)用Doppler的方法存在易出現(xiàn)偽像且后處理過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。本研究通過對(duì)肝纖維化動(dòng)物模型及肝纖維化患者應(yīng)用第二代聲學(xué)造影劑Sono Vue在脈沖反相諧波模式下進(jìn)行肝臟超聲造影，觀察造影劑到達(dá)肝動(dòng)脈、門靜脈、肝靜脈時(shí)間及肝實(shí)質(zhì)時(shí)間一強(qiáng)度曲線變化，探討超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)

3、能否反映肝纖維化進(jìn)展過程中微循環(huán)的變化，并評(píng)價(jià)血清學(xué)、Doppler超聲、CEUS對(duì)肝纖維化的診斷效能。 材料與方法： 1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分健康雄性Wistar大鼠70只，隨機(jī)選取其中的62只大鼠進(jìn)行肝纖維化模型制作，造模方法：首次按4ml/kg劑量經(jīng)皮下注射60％CCl4，以后每周兩次按2ml/kg劑量經(jīng)皮下注射60％CCl4；另8只大鼠為對(duì)照組，每周兩次按2ml/kg經(jīng)皮下注射生理鹽水，首次劑量為4ml/kg。分別于5周

4、、7周、9周、11周隨機(jī)從進(jìn)行造模的大鼠中取10只，從對(duì)照組大鼠中取2只進(jìn)行超聲造影檢查。 首先對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行二維超聲檢查，在同時(shí)顯示門靜脈與肝靜脈的切面切換至CEUS程序。按0.1ml/Kg劑量經(jīng)尾靜脈團(tuán)注微泡聲學(xué)造影劑SonoVue，造影劑注射即刻開始計(jì)時(shí)。結(jié)合逐幀回放模式回放動(dòng)態(tài)圖像，記錄造影劑到達(dá)肝動(dòng)脈時(shí)間(hepatic artery arrival time，HAAT)、造影劑到達(dá)門靜脈時(shí)間(portal vein

5、arrivaltime，PVAT)、造影劑到達(dá)肝靜脈時(shí)間(hepatic vein arrival time，HVAT)，即相應(yīng)血管內(nèi)造影劑開始出現(xiàn)的時(shí)間。計(jì)算造影劑到達(dá)肝動(dòng)脈與到達(dá)肝靜脈間隔時(shí)間(HVAT-HAAT,VAT)、造影劑到達(dá)門靜脈與到達(dá)肝靜脈間隔時(shí)間(HVAT-PVAT, VVT)。進(jìn)入TIC ANALYSIS程序，感興趣區(qū)置于圖像中場(chǎng)，獲得肝實(shí)質(zhì)時(shí)間一強(qiáng)度曲線，記錄達(dá)峰時(shí)間、峰值強(qiáng)度、上升斜率、下降斜率。所有動(dòng)物在超聲檢

6、查后心臟取血5ml，檢測(cè)肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，包括HA、PCⅢ、C-Ⅳ和LN。切除肝組織以10％甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色、Masson染色、網(wǎng)狀纖維染色，光鏡下判定肝纖維化程度。Envision二步法進(jìn)行C-Ⅳ、LN免疫組化染色。切除肝組織以2.5％戊二醛固定，常規(guī)制作電鏡切片，透射電鏡觀察肝組織的超微結(jié)構(gòu)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以病理肝纖維化分期為依據(jù)進(jìn)行分組，不同肝纖維化分期血清學(xué)指標(biāo)、免疫組化結(jié)果、CEUS結(jié)果的比較采用單因素

7、方差分析。血清學(xué)指標(biāo)與免疫組化結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)分析。CEUS結(jié)果與血清學(xué)指標(biāo)、免疫組化結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)分析。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、臨床研究部分收集我院經(jīng)肝組織穿刺活檢確診的慢性病毒性肝炎患者32例，其中男18例，女14例，年齡18-64歲，平均36.9歲。其中無纖維化組(S0期)7例，輕度肝纖維化組(S1期/S2期)11例，中度肝纖維化組(S3期)6例，重度肝纖維化組(S4期)8例，對(duì)照組6例，平均33.5歲。

8、 檢測(cè)肝纖維化血清學(xué)直接指標(biāo)：HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN。計(jì)算肝纖維化血清學(xué)間接指標(biāo)APRI、Forns指數(shù)。 Doppler超聲測(cè)量肝動(dòng)脈峰值血流速度(hepatic artery peak velocity，HAP)及阻力指數(shù)(hepatic artery resistive index，HARI)；門靜脈直徑(portal vein diameter，PVD)、門靜脈峰值血流速度(portal vein peak v

9、elocity，PVP)；計(jì)算肝動(dòng)脈/門靜脈血流速度比值(HAP/PVP)。測(cè)量脾臟長(zhǎng)徑(spleen length，SPL)。 CEUS檢查：受檢者仰臥位，在基波狀態(tài)下于右肋間斜切面使門靜脈及肝中靜脈顯示在同一切面上，切換至超聲造影程序，按0.03ml/Kg劑量經(jīng)肘靜脈團(tuán)注造影劑SonoVue，從注射造影劑即刻開始計(jì)時(shí)。結(jié)合逐幀回放模式回放動(dòng)態(tài)圖像，記錄HAAT、PVAT、HVAT，計(jì)算VAT、VVT。進(jìn)入TIC ANALYS

10、IS程序，感興趣區(qū)置于圖像中場(chǎng)，獲得肝實(shí)質(zhì)時(shí)間-強(qiáng)度曲線，記錄達(dá)峰時(shí)間、峰值強(qiáng)度、上升斜率、下降斜率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：不同組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析。各指標(biāo)與肝纖維化程度進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析。對(duì)于組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)，分別以S＞1，S=4為判定肝纖維化和早期肝硬化的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用ROC分析法評(píng)價(jià)其診斷肝纖維化的價(jià)值。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分 對(duì)照組8只大鼠全部

11、存活，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無變性、壞死，無纖維間隔形成。進(jìn)行造模的大鼠于給藥4周后陸續(xù)開始出現(xiàn)死亡，按病理肝纖維化分期：S0期3只， S1期9只， S2期8只， S3期9只， S4期11只。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞變性、壞死，逐漸形成纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，最終形成假小葉。電鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞失窗孔，內(nèi)皮下基底膜形成，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量膠原纖維。隨著肝纖維化加重，C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應(yīng)面積百分比增加，血清HA、PCⅢ、

12、C-Ⅳ、LN水平隨肝纖維化加重呈上升趨勢(shì)。血清學(xué)HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN水平與C-Ⅳ、LN免疫組化表達(dá)呈正相關(guān)。 對(duì)照組、S1期-S4期HAAT、PVAT兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S3期、S4期HVAT、VAT、VVT較對(duì)照組、S1期、S2期縮短。肝實(shí)質(zhì)時(shí)間-強(qiáng)度曲線分析：S3期、S4期峰值強(qiáng)度及下降斜率較對(duì)照組、S1期、S2期降低。 HVAT與血清學(xué)指標(biāo)HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈負(fù)相關(guān)，VAT、VVT與血清學(xué)指標(biāo)H

13、A、PCⅢ、LN呈負(fù)相關(guān)。肝實(shí)質(zhì)時(shí)間-強(qiáng)度曲線峰值強(qiáng)度及下降斜率與血清學(xué)指標(biāo)HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN呈負(fù)相關(guān)。 HVAT、VAT、VVT與C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應(yīng)面積百分比呈負(fù)相關(guān)。肝實(shí)質(zhì)時(shí)間．強(qiáng)度曲線峰值強(qiáng)度、下降斜率與C-Ⅳ、LN免疫組化染色陽性反應(yīng)面積百分比呈負(fù)相關(guān)。 2、臨床研究部分 肝纖維化血清學(xué)直接指標(biāo)HA、PCⅢ、C-Ⅳ、LN及間接指標(biāo)APRI、Foms指數(shù)與肝纖維化程度呈正相關(guān)。ROC分

14、析表明HA、PCⅢ、LN診斷早期肝硬化(S=4)的AUC為0.733～0.800(P<0.05)，APRI、Fores指數(shù)診斷早期肝硬化的AUC分別為0.765(P<0.05)、0.900(P<0.05)。 各組PVD、PVP、HAP、HAP/PVP、HARI、SPL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 HVAT、VAT、VVT與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，中度及重度肝纖維化組HVAT、VAT、VVT縮短， ROC分析表明HVAT、VAT、

15、VVT診斷早期肝硬化(S=4)的AUC為0.829～0.835(P<0.05)。肝實(shí)質(zhì)時(shí)間一強(qiáng)度曲線達(dá)峰時(shí)間與肝纖維化程度呈正相關(guān)，峰值強(qiáng)度、上升斜率、下降斜率與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，中度及重度肝纖維化組峰值強(qiáng)度、下降斜率減低，重度肝纖維化組達(dá)峰時(shí)間延后，上升斜率減低。ROC分析表明上升斜率及下降斜率診斷早期肝硬化的AUC為0.731(P<0.05)及0.850(P<0.05)。 結(jié)論： 1、CEUS是安全的影像學(xué)檢查方

16、法，應(yīng)用CEUS可以觀察肝動(dòng)脈、門靜脈、肝靜脈顯影過程以及肝實(shí)質(zhì)一時(shí)間強(qiáng)度曲線的變化特點(diǎn)，揭示肝纖維化血流動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律。 2、CEUS在臨床研究與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果具有一致性，肝纖維化S3期、S4期HVAT、VAT、VVT縮短，肝實(shí)質(zhì)時(shí)間一強(qiáng)度曲線峰值強(qiáng)度、下降斜率減低等變化與肝竇毛細(xì)血管化及肝臟動(dòng)脈血化、肝內(nèi)分流形成等肝內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)。 3、CEUS指標(biāo)有助于評(píng)價(jià)中、重度肝纖維化。CEUS缺乏早期診斷肝纖維化(S