用于CHO大規(guī)模表達(dá)的質(zhì)粒載體的構(gòu)建鑒定及相關(guān)工作建立.pdf

1、　　目的：本研究的目的是建立一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),能夠高效表達(dá)外源目的蛋白,為將來應(yīng)用于表達(dá)藥用重組蛋白提供基礎(chǔ)：對CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的上游轉(zhuǎn)染、篩選條件和檢測方法進(jìn)行探索和優(yōu)化,并構(gòu)建適用于CHO細(xì)胞大規(guī)模表達(dá)的、能提高外源蛋白表達(dá)效率的通用載體,并對該載體進(jìn)行初步的檢測。
　　方法：本研究對CHO細(xì)胞株的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件和G418篩選條件進(jìn)行優(yōu)化研究、并用基因組PCR、RT-PCR、dot-ELISA、間接ELI

2、SA、細(xì)胞免疫熒光和MTT法對由該CHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的分泌型蛋白如分泌型bFGF的表達(dá)進(jìn)行檢測；根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,通過半巢式PCR方法,從CHO基因組中分離出抗阻遏子元件,克隆到pIRESneo3載體真核轉(zhuǎn)錄本的兩側(cè),構(gòu)建成一個(gè)通用載體,然后采用分泌型bFGF、綠色熒光蛋白等作為報(bào)道基因,通過篩選后克隆計(jì)數(shù)、MTT測活法和熒光強(qiáng)度對比等方法對該表達(dá)載體進(jìn)行初步的研究和檢測。
　　結(jié)果：24孔板中CHO/dhfr-的最佳轉(zhuǎn)染條件為脂質(zhì)體

3、2μg和DNA2μl,G418最佳篩選條件為500μg/ml；轉(zhuǎn)染后,檢測到外源基因整合到基因組,并檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄,MTT法間接檢測到該基因的分泌表達(dá)：從CHO細(xì)胞基因組中分離得到的抗阻遏子元件與文獻(xiàn)報(bào)道有97%同源；成功構(gòu)建了pInAR2質(zhì)粒載體,檢測到抗阻遏子元件對外源基因的表達(dá)有增強(qiáng)作用。
　　結(jié)論：本研究對CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源蛋白進(jìn)行了初步的研究和條件的確立；構(gòu)建了一個(gè)含有抗阻遏子元件的質(zhì)粒型通用載體,該載體