選擇性抑制NF-κB活性對(duì)白血病K562細(xì)胞Survivin表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的 1.觀察選擇性地抑制核因子-кB活性對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響； 2.觀察蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)核因子-кB活性及凋亡抑制蛋白Survivin表達(dá)的影響； 3.探討核因子-кB活性和凋亡抑制蛋白Survivin表達(dá)的相互關(guān)系； 4.探討NF-кB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 方法 細(xì)胞系為人髓系白血病細(xì)胞系K562，首先進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)

2、胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分5組，空白對(duì)照組不加MG132，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的MG132(終濃度分別為2、4、6、8 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)NF-кB p65活性和Survivin蛋白的表達(dá)，Westem印跡定量分析NF-1cB活性和Survivin的表達(dá)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)復(fù)孔3個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 結(jié)果

3、1.不同濃度的MG132作用于細(xì)胞24h后可觀察到K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，光鏡下可觀察到K562細(xì)胞染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析MG132對(duì)K562細(xì)胞的致凋亡作用，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞凋亡率隨著MG132濃度的升高而逐漸上升，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別為11.2﹪±2.5﹪、17.2﹪±2.3﹪、21.7﹪±1.8﹪和24.3﹪±3.4﹪，與對(duì)照組比較均有明顯差異(P<0.01)，表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

4、2.NF-κB p65和Survivin蛋白在K562細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示NF-κBp65和Survivin蛋白在K562細(xì)胞內(nèi)的異常高表達(dá)，NF-κB p65表達(dá)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒，位于細(xì)胞漿/細(xì)胞核，Survivin表達(dá)位于細(xì)胞漿，亦呈棕褐色顆粒。兩者在MG132作用于細(xì)胞24h后其表達(dá)水平均明顯下降。 3.Western印跡定量分析NF-κB p65和Survivin蛋白表達(dá)量的變化及其相互關(guān)系：Weste

5、mEP跡檢測(cè)顯示，MG132作用于K562細(xì)胞24 hA，NF-κB p65和Survivin蛋白的表達(dá)都明顯下調(diào)。而且，隨著MG132濃度的增加其表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)，NF-κB p65蛋白表達(dá)分別下調(diào)至作用前的75.0﹪±3.7﹪、59.9﹪4±5.3﹪、45.4﹪±5.7﹪和25.0﹪±4.2﹪，而Survivin蛋白表達(dá)分別下調(diào)至作用前的90.9﹪±10.1﹪、66.7﹪±5.2﹪、45.4﹪±5.7﹪和30.3﹪±6.6﹪，提

6、示NF-κB p65活性降低的同時(shí)Survivin蛋白的表達(dá)也下調(diào)，兩者呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)t=0.989，P<0.01)。 結(jié)論 1.MGl32可以有效地抑制NF-κB的活性，誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)； 2.NF-κB的活性下調(diào)的同時(shí)抗凋亡蛋 Survivin的表達(dá)也隨之下調(diào)，Survivin蛋白的表達(dá)和NF-κB活性密切正相關(guān)； 3.MG132能效地選擇性地抑制NF-κ