利用Knock in技術(shù)，在肝癌細胞系中穩(wěn)定表達HBV的X抗原.pdf

1、乙型肝炎病毒感染（Hepatitis B virus，HBV）呈全球范圍廣泛流行，在我國尤為嚴重。HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是嚴重危害人類健康的感染性疾病。很多流行病學(xué)與實驗證據(jù)表明HBV的感染與原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular，HCC）的發(fā)生有很大的相關(guān)性。HBV攜帶者與非HBV攜帶者發(fā)生HCC的比例為200：1。HBV在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用是毋庸置疑的，但是其中具體的機制

2、仍然不清楚。
　　 人類HBV屬于嗜肝DNA病毒科，其基因組DNA為部分環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，長約3.2kb?；蚪M中含有四個主要的相互重疊的開放讀碼框（Open reading flame，ORF），分別為S、C、P、X。S-ORF分為S基因、前S2區(qū)和前S1區(qū)，各有其起始密碼ATG，C-ORF分為C基因和前C區(qū)，各有起始密碼ATG，P-OFR是最長的讀架，其開始區(qū)段與C-ORF重疊，中間與S-ORF重疊，最后區(qū)段與X-ORF重疊，

3、X-ORF在nt1374-1837，adr亞型有27bp的短縮，為其中最小的一種ORF。X蛋白（pX）對轉(zhuǎn)錄有反式激活功能，在HBV介導(dǎo)的致癌作用中作為輔助因子發(fā)揮了重要作用，但具體的致癌機制仍不明確。
　　 目的：為了更好的研究pX的功能及在HCC的發(fā)生發(fā)展中的作用，我們運用基因敲入技術(shù)在人肝癌細胞株SMMC7721中構(gòu)建穩(wěn)定并且高效表達HBV X基因的細胞株，穩(wěn)定細胞株的成功建立也同時為制備、純化pX提供了良好的實驗材料。也

4、為穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建提供了新的方法和視野。
　　 方法：通過電擊轉(zhuǎn)染將基因誘捕載體pU17導(dǎo)入到人類肝癌細胞系SMMC7721，經(jīng)G418篩選，報告基因X-gal染色后得到X-gal高表達的陽性克??；在這些高表達X-gal的陽性克隆中通過Cre-LoxP置換系統(tǒng)，把HBx基因敲入到細胞的染色體中，再通過基因組PCR、斑點雜交等方法檢測HBx DNA的存在和pX蛋白質(zhì)的表達。
　　 結(jié)果：得到永久性高表達誘捕載體報告基因X-