內(nèi)毒素脂多糖影響腎小管上皮細胞GRP78及CHOP轉(zhuǎn)錄活性的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 感染與慢性腎臟病的發(fā)生及進展密切相關(guān)。內(nèi)毒素脂多糖(LPS)是由革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生,可直接或間接導(dǎo)致腎臟的損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞對各種有害刺激非常關(guān)鍵的應(yīng)答機制,過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起細胞功能的異常甚至細胞的凋亡。糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志蛋白,而凋亡信號分子CHOP參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中細胞的損傷與凋亡。目前內(nèi)毒素脂多糖損傷腎小管上皮細胞中是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究報道甚少。本實驗采用不同

2、濃度的內(nèi)毒素脂多糖持續(xù)刺激培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞)不同的時間,采用RT-PCR方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和凋亡信號分子CHOP轉(zhuǎn)錄活性的改變,以探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)毒素脂多糖至大鼠腎小管上皮細胞損傷中的作用及其機制。
　　 方法：
　　 復(fù)蘇大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E細胞),于含10％胎牛血清、100 U／ml青霉素及100 U／ml鏈霉素的DMEM／F121:1培養(yǎng)液中,置于CO

3、2培養(yǎng)箱37℃、5％CO2、95％濕度條件下進行培養(yǎng),24-48h后,細胞生長至80％-90％融合時進行傳代。待細胞再次生長至80％融合時,于不含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h使其同步化后進行實驗。將所培養(yǎng)細胞隨機分為四組,分別加入不同濃度的內(nèi)毒素脂多糖(0ng／ml,10ng／ml,100ng／ml,1000ng／ml)進行刺激,分別于刺激12h、24h和36h提取細胞總RNA,并將各組總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴增后進行電泳檢測

4、GRP78和CHOPmRNA表達的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.NRK-52E細胞在無內(nèi)毒素脂多糖刺激時于培養(yǎng)不同時間GRP78和CHOPmRNA存在低量的基礎(chǔ)表達,且隨培養(yǎng)時間的變化,基礎(chǔ)表達無顯著變化。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示:較低濃度的內(nèi)毒素脂多糖(10ng／ml)在較短的刺激時間(12h)內(nèi)即可誘導(dǎo)NRK-52E細胞GRP78與CHOP mRNA高表達,與0ng／ml濃度刺激組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)

5、意義(P<0.01)。
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示:培養(yǎng)基中內(nèi)毒素脂多糖濃度愈高、刺激時間愈長,GRP78與CHOP mRNA表達愈高；在內(nèi)毒素脂多糖100ng／ml,1000ng／ml濃度刺激NRK-52E細胞12h、24h時,GRP78與CHOP mRNA表達顯著高于LPS(0mg／ml,10ng／ml)組刺激12h、24h時,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在LPS10ng／ml,100ng／ml,1000ng／m

6、l刺激12h、24h、36h時,NRK-52E細胞GRP78與CHOP mRNA的表達顯著高于LPS(0mg／ml)組刺激12h、24h、36h時,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而GRP78與CHOP mRNA的表達在高濃度LPS(1000ng／ml)刺激24h與36h時,相比均無顯著差異(P>0.05)
　　 結(jié)論：
　　 1.內(nèi)毒素脂多糖可誘導(dǎo)NRK-52E細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 2.內(nèi)毒素脂多糖誘