Herceptin-NKG2D配體融合蛋白的抗腫瘤研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的的治療方法包括：手術(shù)切除、放射療法、化學(xué)療法。手術(shù)切除對早期和中期的腫瘤比較有效，但不能阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移，也不能殺傷血液中的癌細(xì)胞；而放療和化療雖然能很快地殺死癌細(xì)胞，但對正常細(xì)胞也會造成很大傷害，所以傳統(tǒng)療法很難根治腫瘤。因此，腫瘤的靶向治療已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的重要途徑。
　　 隨著單克隆抗體(MAb)技術(shù)的發(fā)展，抗體治療已經(jīng)成為治療腫瘤的新途徑?？贵w治療藥物相對其他治療藥物具有更高的靶點(diǎn)特

2、異性，毒副作用低，并能夠攜帶其他抗腫瘤藥物到達(dá)靶細(xì)胞，誘發(fā)針對機(jī)體的免疫反應(yīng)等特點(diǎn)。目前已經(jīng)有多種抗體通過臨床實(shí)驗，Herceptin（赫賽汀）是最先通過美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的治療實(shí)體瘤的抗體藥物，應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。雖然抗體治療相對傳統(tǒng)治療有很多優(yōu)點(diǎn)，但是還存在很多不足：如抗體藥物生產(chǎn)成本高，技術(shù)很難掌握，而且用量很大，對大的實(shí)體瘤的治療效果不好。
　　 自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cells，

3、NK細(xì)胞）是先天免疫系統(tǒng)中的一類淋巴細(xì)胞。它表面分布著活化型受體NKG2D。乳腺癌、卵巢癌等大多數(shù)上皮腫瘤細(xì)胞都存在NKG2D的配體表達(dá)，這些配體為主要組織相容性復(fù)合體I類(MIC-I)鏈相關(guān)蛋白MICA和MICB，這些配體可以與NK細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。NK細(xì)胞表面的FcγRⅢ(CD16)與抗體的Fc段識別結(jié)合后，使自身活化，誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，從而殺傷靶細(xì)胞。
　　

4、本課題通過改造攜帶具有治療實(shí)體瘤效果的抗HER-2人源化單克隆抗體Herceptin基因的5型腺病毒載體，在抗體基因的重鏈恒定3區(qū)(CH3)連接上NKG2D配體MICB的基因，構(gòu)建出Herceptin-NKG2D配體的融合蛋白基因。經(jīng)過體外實(shí)驗證明這種攜帶融合蛋白基因在腺病毒Ad-AT5-MICB是否能表達(dá)以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷情況。該研究為了證明Herceptin-NKG2D配體融合蛋白對腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用要強(qiáng)于單獨(dú)的Hercep

5、tin抗體的作用，并且能進(jìn)一步聯(lián)合NK細(xì)胞殺傷腫瘤，高效地誘導(dǎo)ADCC作用，提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。希望該Herceptin-NKG2D配體融合蛋白能對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生“融合蛋白+NK細(xì)胞”聯(lián)合殺傷作用。
　　 該課題的實(shí)驗過程如下：首先將NKG2D的配體MICB的基因片段插入含有全長抗體Herceptin基因的5型腺病毒穿梭載體pDC339-AT5中，與腺病毒骨架載體pBHGloxAEl，3Cr重組，然后在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒包

6、裝得到非增殖型腺病毒Ad-AT5-MICB，純化后測病毒滴度。在體外實(shí)驗中，選用HER-2陽性的卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)釋放法殺傷實(shí)驗，證明融合蛋白的體外殺傷效果。
　　 本課題構(gòu)建的Herceptin-NKG2D配體融合蛋白，同時攜帶Herceptin全長抗體基因和MICB基因。在體外，該融合蛋白能正常表達(dá)且對腫瘤細(xì)胞具有較好的殺傷效果。該融合蛋白在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果有待于通過實(shí)驗進(jìn)一步實(shí)驗證明，而初