318例中國漢族非綜合征型聾病人群三個耳聾基因突變頻譜分析.pdf

1、目的：
　　1.收集溫州醫(yī)學(xué)院各大合作醫(yī)院門診患者的臨床資料，了解非綜合征型聽力損失(nonsyndromic hearing loss，NSHL)的發(fā)病情況。
　　2.通過統(tǒng)一的調(diào)查方法、標(biāo)本采集，利用基因診斷方法對門診非綜合征型耳聾患者及其家系成員進行線粒體12S rRNA基因和核基因GJB3口GJB6基因突變檢測，繪制基因突變頻譜，分析這3個基因突變在NSHI發(fā)病中的作用。
　　3.對攜帶有A1555G和C149

2、4T突變的患者進行線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)全序列的擴增，尋找新的mtDNA繼發(fā)突變、多態(tài)性位點及mtDNA單倍型分析。
　　4.通過對攜帶GJB3和GJB6基因突變的中國耳聾家系進行臨床、遺傳和分子生物學(xué)特征分析，探討突變位點與耳聾的關(guān)系，為耳聾相關(guān)基因的篩查、耳聾診斷及預(yù)防提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集溫州醫(yī)學(xué)院各合作醫(yī)院耳聾患者血樣318例。并進行詳細的臨床資料分析，建立

3、臨床和分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫。
　　2.采集無親緣關(guān)系正常對照人群血樣本。
　　3.提取所采集血液樣本的全基因組DNA。
　　4.通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerise chain reaction，PCR)擴增技術(shù)對線粒體12SrRNA和核基因GJB3、GJB6基因區(qū)域進行突變篩查。
　　5.PCR產(chǎn)物純化后直接進行測序分析。
　　6.繪制非綜合征型耳聾患者線粒體12S rRNA和核基因GJB3、GJB6基

4、因突變頻譜。
　　7.對攜帶GJB3和GJB6基因突變的中國漢族耳聾家系進行系譜分析，收集臨床相關(guān)資料并進行聽力學(xué)檢查，分析其他可能的因素對這些家系耳聾外顯率的影響。
　　結(jié)果：
　　1.對已收集的318例門診非綜合征型耳聾患者進行線粒體12S rRNA基因篩查，共檢測出線粒體12S rRNA基因上34個已知的突變位點，其中A1555G、C1494T和T1095C突變分別占9.1％、0.6%和1.25%。其中A839G

5、和T1452C突變位于12S rRNA基因的高度保守區(qū)域且未在正常對照中發(fā)現(xiàn)，可能增加了耳毒性藥物的敏感性。
　　2.對已收集的318例門診非綜合征型耳聾患者進行核基因GJB3和GJB6突變篩查，共發(fā)現(xiàn)GJB3基因上10個變異(5個為新變異)位點。其中6個(G250A，C301T，C310T，A544T，G547A，G580A)為錯義突變，4個(G57A，C243T，C357T，C798T)為無義突變。結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示新變異

6、C301T、A544T突變和已知變異G547A、G250A突變位于GJB3基因高度保守區(qū)域且沒有在正常對照人群中發(fā)現(xiàn)，可能與非綜合征型耳聾相關(guān)。其他變異可能為多態(tài)性變異。攜帶GJB3基因變異的13位患者中，只有1例攜帶C243T變異的患者攜帶了GJB2基因235 delC雜合突變。
　　3.318例門診非綜合征型耳聾患者GJB6基因突變篩查共發(fā)現(xiàn)2個變異位點，其中1個為228del G雜合突變，該突變導(dǎo)致終止密碼子提前至第81位，

7、翻譯的多肽與野生型蛋白相比截短了181個氨基酸。在19個物種中進行Cx30氨基酸序列保守性分析證實，該位點保守性為100%；另外1例攜帶GJB6基因G630A雜合點突變，為同義突變L210L，保守性為94.7%。對照組中未發(fā)現(xiàn)這兩種突變。
　　4.我們分析了線粒體12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6上各個突變位點與耳聾表型之間的關(guān)系；明確了中國NSHI門診病例線粒體12S rRNA和核基因GJB3和GJB6的突變發(fā)生頻率

8、；繪制了中國NSHI人群線粒體12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6的突變頻譜。
　　5.318例中國漢族NSHI人群中未發(fā)現(xiàn)同時攜帶線粒體12S rRNA、GJB3和GJB6基因變異的患者。
　　結(jié)論：
　　1.線粒體12S rRNA基因突變篩查發(fā)現(xiàn)，與藥物性耳聾相關(guān)的A1555G突變有29例，C1494T突變只檢測出1例，而在449名正常對照的線粒體DNA中并沒有發(fā)現(xiàn)該突變，說明這兩種突變是藥物性耳聾的主要

9、致病形式。線粒體DNA繼發(fā)突變、線粒體DNA多態(tài)性及其他核修飾基因可能對這些耳聾家系的表型表達起到修飾作用。這些數(shù)據(jù)為氨基糖甙類抗生素耳毒性和非綜合征型耳聾的預(yù)防和耳聾基因診斷的開展提供可靠的依據(jù)。
　　2.GJB3基因篩查發(fā)現(xiàn)的可能的致病突變均為雜合形式，提示GJB3基因可能以雜合突變形式影響中國人群聽力情況，該基因突變患者的耳聾表型表達還可能與其他因素如線粒體單倍型、其它核修飾基因或環(huán)境等有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)為研究中國漢族非綜合征

10、型聾病人群的致聾因素提供了有價值的信息和技術(shù)。
　　3.GJB6基因篩查共發(fā)現(xiàn)2例變異，說明GJB6基因突變在本研究人群中變異頻率較低，可能是由于樣本量不夠大或GJB6基因在中國人群中突變率本身就低，有待于進一步擴大樣本量來驗證。對已發(fā)現(xiàn)的228 del G雜合突變的致病性，仍需要進一步功能驗證。
　　4.本項工作為隱性遺傳性非綜合征型耳聾的分子診斷提供了可靠的方法，對聾病產(chǎn)前診斷、遺傳篩查和遺傳咨詢提供理論依據(jù)，為開展耳聾