Erbin在β2-AR介導(dǎo)MAPK信號通路中的調(diào)控作用及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、研究背景：β腎上腺素能受體(β-AR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的重要成員。表達于心臟組織的β腎上腺素能受體可接受兒茶酚胺的刺激，從而將來自交感神經(jīng)系統(tǒng)的信息轉(zhuǎn)換為體內(nèi)生理學(xué)功能刺激信號，從而調(diào)控心肌細胞的生物學(xué)功能，但其具體調(diào)控的機制尚未完全闡明。
　　 Her2，原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)基因，人類表皮生長因子受體家族成員

2、之一。近年來，通過對Her2的基因敲除小鼠的研究，Her2在心肌細胞中的功能，特別是其在心肌細胞保護方面的作用逐漸被人們所認識。而且臨床上使用靶向Her2的治療性抗體赫賽汀(Herceptin)的應(yīng)用可在某些患者中引起明顯的心臟毒性，亦表明Her2在心肌細胞內(nèi)的作用至關(guān)重要，但是其機理尚不明確。
　　 隨即，2006年，Alejandra Negro等研究發(fā)現(xiàn)在心肌細胞內(nèi)Her2與β2-AR存在相互作用，而且他們之間的這種相互作

3、用對于兒茶酚胺誘導(dǎo)的MAPK信號通路的活化及心肌細胞收縮功能的調(diào)控至關(guān)重要。研究者在文中明確指出Her2與β2-AR存的相互作用并非直接相互作用，而是可能通過某個支架分子介導(dǎo)的間接相互作用，具體機制不清楚。然而，2000年Borg等以HER2胞內(nèi)域殘基為釣餌，通過酵母雙雜交的方法從cDNA文庫中篩選到一種新的含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，將其命名為ErbB2相互作用蛋白(ErbB2 interacting protein)，簡寫為Erbin。

4、Erbin的序列分析表明，Erbin可能具有支架分子的功能，最近的相關(guān)研究也證明Erbin可作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與其它受體分子發(fā)生相互作用。
　　 我們的前期研究結(jié)果提示，在心肌細胞內(nèi)Erbin可能作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用。隨后通過一系列的研究，我們發(fā)現(xiàn)Erbin的PDZ結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用，并在β2-AR介導(dǎo)的MAPK信號通路活化中起到正向調(diào)控作用，本研究還首次報道了Erb

5、in在心肌細胞中的新功能。
　　 目的：研究在細胞內(nèi)，Erbin是否是作為支架蛋白介導(dǎo)Her2與β2-AR復(fù)合物形成的必要分子，及其揭示Erbin在心肌細胞中對β2-AR激動劑誘導(dǎo)的MAPK信號通路活化的調(diào)控作用，初步探索Erbin對心肌細胞生物學(xué)功能的影響。
　　 方法：利用免疫共沉淀的方法，在心肌及腦組織初步驗證Erbin、β2-AR及Her2三者存在相互作用；進一步利用免疫共沉淀的方法，進行內(nèi)源性，外源性檢測Erb

6、in、β2-AR及Her2三者存在相互作用；我們進行內(nèi)源性敲低Erbin的表達，利用免疫共沉淀證明Erbin是介導(dǎo)β2-AR與Her2復(fù)合物形成的必要分子，同時通過膜，漿分離實驗來證明Erbin在兒茶酚胺激素下被招募到細胞膜上，是其發(fā)揮作用的前提。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建Erbin及其突變體，通過免疫共沉淀及免疫熒光的方法，確定Erbin介導(dǎo)β2-AR與Her2相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。通過SDS-PAGE和Western blot方法檢測E

7、rbin在ISO刺激β2-AR介導(dǎo)的MAPK信號通路中調(diào)控作用。進一步通過TUNEL染色法檢測Erbin在心肌細胞內(nèi)抗調(diào)亡作用，利用胰酶消化法分離與培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，通過慢病毒轉(zhuǎn)染高效敲低Erbin，熒光顯微鏡下觀察，記錄心肌細胞心率的變化，初步探索Erbin在心肌細胞內(nèi)潛在的生物學(xué)功能。
　　 結(jié)果：首先，我們在大鼠的心肌組織及腦組織，初步驗證了Erbin，β2-AR，Her2三者之間存在相互作用；接下來我們在293T(組

8、成性表達Erbin)細胞內(nèi)，通過外源性過表達pcDNA3.0-β2-AR、pcDNA3.0-Her2兩種質(zhì)粒，證實Erbin、β2-AR及Her2三者之間存在相互作用；那么在心肌細胞是否也存在呢?我們研究證明在大鼠心肌細胞H9c2內(nèi)源性檢測結(jié)果，Erbin、β2-AR及Her2三者之間也存在相互作用。相反，如果敲低大鼠心肌細胞H9c2內(nèi)Erbin的表達，是否會影響這種作用呢?我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌細胞H9c2內(nèi)敲低Erbin的表達，E

9、rbin、β2-AR及Her2三者之間相互作用被破壞?？梢?，Erbin是介導(dǎo)β2-AR與Her2兩者之間相互作用的必要分子。那么，Erbin是通過什么樣的機制介導(dǎo)了膜上蛋白分子之間的作用呢?我們的膜，漿分離實驗證明Erbin在兒茶酚胺激素下被招募到細胞膜上，發(fā)揮其支架蛋白的作用。免疫共沉淀及免疫熒光的結(jié)果都證實Erbin的PDZ結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)β2-AR與Her2兩者之間相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。在隨后的實驗中，我們進一步發(fā)現(xiàn)Erbin在β2-

10、AR介導(dǎo)的MAPK信號通路中正調(diào)控作用。此外，在我們的研究中，我們同時還發(fā)現(xiàn)Erbin可保護心肌細胞免受兒茶酚胺慢性刺激誘導(dǎo)的細胞凋亡及Erbin可能在調(diào)控心肌細胞搏動頻率中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論：本研究證明Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Her2與β2-AR之間的相互作用以及Erbin在β2-AR介導(dǎo)MAPK信號通路中起著正向調(diào)控作用；同時Erbin可保護心肌細胞免受兒茶酚胺慢性刺激誘導(dǎo)的細胞凋亡，并初步揭示了Erbin可能在