AFP特異性miRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其在胃癌細(xì)胞株FU97中沉默效應(yīng)的鑒定.pdf

1、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是哺乳動物和其他脊椎動物胚胎時期由肝臟和卵黃囊產(chǎn)生的主要的血清蛋白，在正常成年人的外周血中基本檢測不到。甲胎蛋白自被發(fā)現(xiàn)以來，作為一個胎兒異常和腫瘤的標(biāo)志物，在臨床診斷和病情監(jiān)測等方面發(fā)揮了重要作用，其在臨床中的意義受到人們的充分研究。然而甲胎蛋白的生理學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用受到的關(guān)注卻相對較少，只是在最近十年中人們才意識到甲胎蛋白在腫瘤生長中的調(diào)節(jié)作用并開始實驗研究

2、。甲胎蛋白作為原發(fā)性肝癌較為敏感而特異性的生化標(biāo)志，在肝癌普查、早期診斷和療效判定等方面發(fā)揮了重要作用，另外某些胃腸道腫瘤及某些生殖系胚胎腫瘤也高水平表達(dá)AFP，如最近常報道的一種高水平表達(dá)AFP的胃癌，甲胎蛋白陽性胃癌(alpha-fetoprotein-producinggastriccarcinoma，AFP-GC)是一種特殊類型的胃癌，特征是AFP升高及腫瘤組織表達(dá)AFP升高，其臨床病理學(xué)特征與普通型胃癌有較大不同，更易發(fā)生肝轉(zhuǎn)

3、移和早期淋巴道轉(zhuǎn)移，具有明顯的侵襲性和惡性生物學(xué)行為，發(fā)病率約占胃癌的5.1％-15％。由于AFP-GC患者就診時多有轉(zhuǎn)移，常不能手術(shù)根治切除，切除后也易復(fù)發(fā)，故尋找新的治療藥物和治療手段乃當(dāng)務(wù)之急。 RNA干擾((RNAinterference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)，是一種雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或

4、使其沉默的過程。目前，在某些病毒性疾病的治療研究中己取得了一定的進(jìn)展，在基因功能研究和基因治療方面也己顯示出巨大的應(yīng)用前景。 miRNA是近年來在多種真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈RNA，長度為21-25nt左右的短序列，在進(jìn)化上具有高度的保守性，能通過與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，在基因調(diào)控中扮演著重要的角色。 我們利用miRN

5、A的這一內(nèi)源生物現(xiàn)象和RNA干涉技術(shù)人為的設(shè)計出miRRNAi的載體，這個載體上含有一個miR-155結(jié)構(gòu)區(qū)域，miR-155是經(jīng)實驗證明的在哺乳動物體(小鼠)體內(nèi)的一個能生成miRNA的60-70nt內(nèi)源性前體miRNA(pre-miRNA)。這個載體轉(zhuǎn)入體內(nèi)后既能夠形成一個成熟的miRNA(非編碼的單鏈RAN)又能使其有效的發(fā)揮RNAi作用。我們選擇了專門為之設(shè)計的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESS

6、IONVECTOR載體。在體外構(gòu)建了能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)miRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，在FU97細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出miRNA從而引發(fā)基因沉默，觀察其對FU97細(xì)胞AFP基因表達(dá)的抑制作用及其對細(xì)胞生長增殖抑制作用。 目的： 以可特異性表達(dá)甲胎蛋白的人胃癌細(xì)胞株FU97為研究目標(biāo)，利用miRNA的生物學(xué)現(xiàn)象和RNA干涉技術(shù)，構(gòu)建能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)AFP-miRNA的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRE

7、SSIONVECTOR載體，通過體外試驗探討AFP特異性miRNA抑制甲胎蛋白陽性胃癌細(xì)胞株FU97的AFP基因表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖以及其作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究AFP基因功能奠定基礎(chǔ)，以期為其治療提供一個新的特異性基因治療手段，同時為獲得AFP基因的最佳miRNA序列和RNAi應(yīng)用于臨床胃癌提供實驗基礎(chǔ)。 方法： (1)選擇3個符合條件的AFP特異性RNA干涉靶序列，分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，與線性載體pc

8、DNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR連接，轉(zhuǎn)化到OneShotTOP10大腸桿菌中擴(kuò)增，提取并純化質(zhì)粒。 (2)采用DNA瓊脂糖凝膠電泳及應(yīng)用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequentingprimer進(jìn)行PER鑒定和序列鑒定，以確定合成的寡核苷酸是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入載體質(zhì)粒中及是否有堿基異常存在。確定載體構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染入FU97細(xì)

9、胞中。 (3)用脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體不同劑量及濃度配比轉(zhuǎn)染FU97細(xì)胞，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率，并檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液AFP含量的變化，篩選出最佳陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體配比。 (4)在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞48小時后，用RT-PCR法檢測AFP基因在mRNA水平的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、流式細(xì)胞儀、westernblot檢測AFP蛋白表達(dá)變化。篩選出AFP基因的最佳miRNA序列。 (5)用篩

10、選出的AFP-miRNA轉(zhuǎn)染FU97細(xì)胞，MTT實驗檢測抑制AFP基因后對FU97細(xì)胞生長增殖抑制作用。 結(jié)果： (1)成功構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTORAFP-1/2/3載體：①瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，提取質(zhì)粒大小與試劑盒中所提供陽性質(zhì)控質(zhì)粒大小相同，pcDNATM6.2-Gw/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR分子量大小為5.8kb，

11、大小符合；②取1ul的質(zhì)粒擴(kuò)增菌液進(jìn)行插入目的基因PCR反應(yīng)，電泳發(fā)現(xiàn)目的條帶為260bp左右，大小符合兩段引物之間的長度；③基因測序結(jié)果表明插入片段的序列與合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功構(gòu)建miRNA表達(dá)載體。 (2)篩選出最佳的陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配比為10μl:2μg。 (3)RT-PCR結(jié)果表明在mRNA水平，所構(gòu)建的三個質(zhì)粒都可抑制AFP基因的表達(dá)。 (4)蛋白水平AFP基因表達(dá)

12、的變化：①化學(xué)發(fā)光法結(jié)果：取FU97培養(yǎng)上清檢測細(xì)胞分泌的AFP蛋白含量的變化，實驗重復(fù)五次，取平均值。計算實驗組的抑制率，抑制率=(1-實驗組平均值/陰性空白對照平均值)×100％。得出實驗組miRNA-AFP1作用后抑制率為45.55％，實驗組miRNA-AFP3為35.46％。而實驗組miRNA-AFP2抑制率最低為19.19％。統(tǒng)計學(xué)分析顯示實驗組三組與陰性空白對照組之間的AFP水平均不同(P＜0.05)。②免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果：

13、棕黃色顆粒沉著代表甲胎蛋白表達(dá)陽性，轉(zhuǎn)染后48，陰性空白對照組FU97細(xì)胞中的AFP表達(dá)較多，多數(shù)細(xì)胞均有棕黃色顆粒沉著；而實驗組FU97細(xì)胞中僅個別細(xì)胞有棕黃色顆粒沉著。③流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞胞漿蛋白表達(dá)結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48小時，實驗組AFP的胞漿蛋白表達(dá)分別為37.57％，75.07％，65.75％。在6.2-GW/EmGFP-miRRNAiEXPRESSIONVECTOR-AFP1/2/3的作用下，與陰性空白對照相比，AFP的表達(dá)均有降

14、低。說明所構(gòu)建的載體對AFP有沉默作用。④westernblot結(jié)果顯示所構(gòu)建的質(zhì)粒均可抑制AFP蛋白水平的表達(dá)。與陰性空白對照相比，實驗組miRNA-AFP1和miRNA-AFP3抑制效果較明顯，其抑制率分別為49.82％，44.10％，而實驗組miRNA-AFP2的抑制效果最差，抑制率為23.96％。 (5)MTT實驗表明抑制了AFP基因表達(dá)后能夠明顯抑制FU97的生長。 結(jié)論： 在特異表達(dá)AFP的人胃癌細(xì)胞