甲胎蛋白特異性siRNA表達載體的構(gòu)建及其在胃癌細胞株FU97中沉默效應的鑒定.pdf

1、目的甲胎蛋白(AFP，alpha—fetoprotein)自被發(fā)現(xiàn)以來，作為一個胎兒異常和腫瘤的標志物，在臨床診斷和病情監(jiān)測等方面發(fā)揮了重要作用，其在臨床中的意義受到人們的充分研究。然而這幾十年中，甲胎蛋白的生理學功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學作用受到的關注卻相對較少，只是在最近十年中人們才意識到甲胎蛋白在腫瘤生長中的調(diào)節(jié)作用并開始實驗研究。我們以可特異表達甲胎蛋白的人類胃腺癌細胞株(AFP—producing gastric ade

2、nocarcinoma cell line，F(xiàn)Ll97)為研究目標，利用RNA干涉技術，針對甲胎蛋白基因的不同靶序列，構(gòu)建了三個能在哺乳動物細胞中表達小發(fā)夾RNA的表達質(zhì)粒，pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl/2/3(簡寫為pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)，分別觀察其在FU97中對甲胎蛋白基因的沉默作用，并研究抑制甲胎蛋白基因后對此腫瘤細胞生長及凋亡的

3、影響，由此我們可以研究甲胎蛋白在AFP相關腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其在AFP相關腫瘤的基因治療方面潛在的應用價值。方法首先選擇3個符合條件的AFP特異性RNA干涉靶序列，這三段序列分別為：①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量為47％②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量為47％③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量為42％；然后分別體外合成兩段互

4、補的寡核苷酸，與線性載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Dotlor Vector連接；確定構(gòu)建成功后，利用轉(zhuǎn)染試劑將3個重組質(zhì)粒(pDonor Vector-AFF-siRNAl/2/3)和對照質(zhì)粒(包括陽性對照，陰性對照，空白對照)分別導入FU97中，同時此載體可獨立表達DsRed熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后8至12小時在熒光顯微鏡下可通過直接觀察熒光蛋白的表達來計算質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，而不影響siRNA沉默的效果；然后在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

5、入腫瘤細胞48小時后，用相對定量RT-PCR法檢測AFP基因在mRNA水平的變化，而AFP蛋白水平的表達變化則通過化學發(fā)光免疫分析儀檢測培養(yǎng)上清，結(jié)合免疫細胞化學法來檢測；最后通過MTT實驗及流式細胞術(Annexin V/PI雙染色法)，檢測抑制AFP基因后對FU97細胞生長及凋亡的影響。 結(jié)果基因測序結(jié)果表明插入片段的序列與合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功構(gòu)建pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor

6、 VectotAFP-siRNA1/2/3載體；轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下DsRed熒光蛋白表達率達30％，說明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可達30％；RT-PCR結(jié)果表明在mRNA水平，所構(gòu)建的三個質(zhì)粒都可抑制AFP基因的表達；培養(yǎng)上清的結(jié)果進行統(tǒng)計學分析顯示實驗組三組(pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)與空白對照組之間的AFP水平均不同(P<0.01)；MTT實驗表明抑制了AFP基因表達后能夠明顯抑制FU97的生長；用流式細胞術(