甲胎蛋白特異性siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其在胃癌細(xì)胞株FU97中沉默效應(yīng)的鑒定.pdf

1、目的甲胎蛋白(AFP，alpha—fetoprotein)自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，作為一個(gè)胎兒異常和腫瘤的標(biāo)志物，在臨床診斷和病情監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮了重要作用，其在臨床中的意義受到人們的充分研究。然而這幾十年中，甲胎蛋白的生理學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用受到的關(guān)注卻相對(duì)較少，只是在最近十年中人們才意識(shí)到甲胎蛋白在腫瘤生長(zhǎng)中的調(diào)節(jié)作用并開始實(shí)驗(yàn)研究。我們以可特異表達(dá)甲胎蛋白的人類胃腺癌細(xì)胞株(AFP—producing gastric ade

2、nocarcinoma cell line，F(xiàn)Ll97)為研究目標(biāo)，利用RNA干涉技術(shù)，針對(duì)甲胎蛋白基因的不同靶序列，構(gòu)建了三個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小發(fā)夾RNA的表達(dá)質(zhì)粒，pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl/2/3(簡(jiǎn)寫為pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)，分別觀察其在FU97中對(duì)甲胎蛋白基因的沉默作用，并研究抑制甲胎蛋白基因后對(duì)此腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的

3、影響，由此我們可以研究甲胎蛋白在AFP相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并探討其在AFP相關(guān)腫瘤的基因治療方面潛在的應(yīng)用價(jià)值。方法首先選擇3個(gè)符合條件的AFP特異性RNA干涉靶序列，這三段序列分別為：①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量為47％②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量為47％③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量為42％；然后分別體外合成兩段互

4、補(bǔ)的寡核苷酸，與線性載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Dotlor Vector連接；確定構(gòu)建成功后，利用轉(zhuǎn)染試劑將3個(gè)重組質(zhì)粒(pDonor Vector-AFF-siRNAl/2/3)和對(duì)照質(zhì)粒(包括陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，空白對(duì)照)分別導(dǎo)入FU97中，同時(shí)此載體可獨(dú)立表達(dá)DsRed熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后8至12小時(shí)在熒光顯微鏡下可通過(guò)直接觀察熒光蛋白的表達(dá)來(lái)計(jì)算質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，而不影響siRNA沉默的效果；然后在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

5、入腫瘤細(xì)胞48小時(shí)后，用相對(duì)定量RT-PCR法檢測(cè)AFP基因在mRNA水平的變化，而AFP蛋白水平的表達(dá)變化則通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)培養(yǎng)上清，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)法來(lái)檢測(cè)；最后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI雙染色法)，檢測(cè)抑制AFP基因后對(duì)FU97細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響。 結(jié)果基因測(cè)序結(jié)果表明插入片段的序列與合成的AFP寡核苷酸序列完全相符，即成功構(gòu)建pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor

6、 VectotAFP-siRNA1/2/3載體；轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下DsRed熒光蛋白表達(dá)率達(dá)30％，說(shuō)明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)30％；RT-PCR結(jié)果表明在mRNA水平，所構(gòu)建的三個(gè)質(zhì)粒都可抑制AFP基因的表達(dá)；培養(yǎng)上清的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組三組(pDonorVector-AFP-siRNAl/2/3)與空白對(duì)照組之間的AFP水平均不同(P<0.01)；MTT實(shí)驗(yàn)表明抑制了AFP基因表達(dá)后能夠明顯抑制FU97的生長(zhǎng)；用流式細(xì)胞術(shù)(