LPS介導的TLR4信號通路在膀胱癌T24細胞免疫逃逸過程中的作用及其機制的實驗研究.pdf

1、摘要目的：作為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，膀胱癌在其發(fā)生、發(fā)展以及復發(fā)過程中逃避機體免疫監(jiān)督的諸多生物學行為正日益受到廣泛關注。研究表明Toll樣受體4(Toll—likereceptor4，TLR4)在多種惡性腫瘤中存在表達并與某些腫瘤的分期分級密切相關，提示TLR4可能參與了腫瘤的免疫逃逸過程；而共刺激因子B7H1可與T淋巴細胞表面的PD1結合并啟動后者的凋亡過程，是免疫逃逸過程的重要分子。本研究的主要目的即探討LPS介導的TLR4信

2、號通路的活化與B7一Hl表達的關系，并探討他們參與膀胱癌免疫逃逸可能的分子機制。方法：1體外培養(yǎng)膀胱癌T24細胞系，分別以不同濃度的脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)(0、025、05、075、10、2Oug／m1)刺激T24細胞8h，以激活TLR4信號通路。用流式細胞學方法檢測T24細胞表面TLR4的表達情況；分別提取總RNA，用逆轉錄聚合鏈式反應(Reversetranscriptionpolymerasecha

3、inreaction，RTPCR)技術檢測共刺激因子B7HImRNA的表達情況；提取蛋白質，用Western—blot蛋白印跡技術檢測B7H1蛋白質的表達情況；2以濃度1ug／ml的LPS分別刺激T24細胞不同時間(Oh、2h、4h、6h、8h、12h)，以激活TLR4信號通路。用前述方法分別檢測檢測TLR4、B7H1mRNA、B7H1蛋白質的表達情況：3以濃度為1ug／ml的LPS分別刺激T24細胞不同時間(Omin、15min、30

4、min、45min、60min、90min)，提取蛋白質，用Western—blot技術檢測pERK、p—JNK、pP38蛋白的表達情況；4分別用ERK、JNK、P38的特異性抑制劑(O、10、20、40uM)處理T24細胞2h后，再加入lug／m1的LPS刺激20min，提取蛋白質，用western—blot技術檢測pERK、p—JNK、pP38蛋白的表達情況；5分別加入ERK、JNK、P38的特異性抑制劑(0、10、20、40uM)

5、2h后，再加入1ug／m1的LPS刺激T24細胞8h后提取蛋白質，用Western—blot技術檢測B7一H1蛋白質的表達情況；結果：iTLR4、BTH1mRNA及蛋白質表達均隨LPS刺激時間的延長或濃度提升而增加，并且在時間為8h、濃度為10ug／ml時達到高峰。且B7一H1mRNA及蛋白質表達分別與T24細胞表面TLR4的表達呈正相關；2LPS激活TLR4信號通路后，MAPK信號通路中的ERK、JNK、p38的磷酸化水平有不同程度的

6、提高；AbstractSubject：Asthemostprevalentmalignanttumorofurinarysystem，bladdercancerhaslongbeenlucubratedbyitsbiologicalbehaviorsintheimmuneevasionprocess，whichfacilitatesitsoccurrence，developmentandrecurrenceToll—likerecept

7、or4(TLR4)Wasfoundtobeaberrantlyexpressedincertaintumorcells，andwasstronglyrelated誠ththeclinicalpathologicalparameters，suchasgradeandstage，suggestingtheimportantroleTLR4mayplayintheimmuneevasionprocessCostimulatorymolecul

8、eB7H1，aftercombinedtoPD一1expressedonthesurfaceofTcells，CantriggertheprogrammeddeathofTcells，whichisbelievedtocontributetotumorimmuneevasion，tooOurstudyWasaimedtodemonstratetherelationshipbetweenLPSinducedTLR4一signalingpa

9、thwayactivationandB7H1expression，andinvestigatethepromisingmolecularmechanismbetweenthemMethods：1T24bladdercancercell1ineswereculturedinvitroandthentreatedwithdifferentconcentrationoflipopolysaccharide(LPS)(O、025、05、075、

10、10、20p鰣【111)for8hourstoactivatetheTLR4signalingpathwayAndthenTLR4expressionWasexaminedbyflowcytometryanalysis，whileB7H1mRNAandproteinexpressionwereexaminedbyImPCRandWestern—Blotrespectively2T24cellsweretreated誦mLPS(1pg／m

11、1)forOh，2h，4h，6h，8h，12hrespectivelybeforeTLR4B7一H1mRNAandproteinWasexaminedbythemethodslistedearlier3T24cellsweretreatedwithLPS(1斗g／m1)forOmin，15min，30min，45min，60min，90minrespectivelyAndthenpERK，p一心KandpP38expressionwer

12、eexaminedbywestern—blotafterproteinextraction4T24cellswerestimulatedbyLPS(11xg／m1)for20minafterpretreated謝mthespecificinhibitorofERK，MandP38(0，10，20，40㈣，andthenpERK，pⅢKandpP38expressionwereexaminedbywestemblotafterprotei

13、nextraction5T24cellswerestimulatedbyLPS(1gg／m1)for8hoursafterpretreatedwimthespecificinhibitorofERK，ⅢKandP38(0，10，20，40pM)，andthenB7一H1proteinexpressionwereexaminedbywesternblotafterproteinextractionResults：1TLR4，B7H1mRN

14、AandproteinexpressionofT24cellsweresignificantly(pO05)upregulateddependingonthedurationandconcentrationofLPSstimulation，whichreachedpeakattheconcentrationof1p咖landstimulationtimeof8h—Furthermore，B7H1mRNAandproteinexpress