TRPV1在角質(zhì)形成細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)中的作用及藥物的干預(yù)研究.pdf

1、皮膚是機(jī)體最大的器官。角質(zhì)形成細(xì)胞是其主要組成成分，是保護(hù)體內(nèi)器官免受外界環(huán)境有害物質(zhì)刺激的重要生理屏障。大量研究顯示角質(zhì)形成細(xì)胞在一些炎癥性皮膚病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。一旦受到外界因素和細(xì)胞因子的刺激，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞能分泌多種炎癥因子，從而積極地參與機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)。如角質(zhì)形成細(xì)胞參與變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)生、發(fā)展的全過程。在一些遺傳因素相關(guān)的皮膚病，如特應(yīng)性皮炎，角質(zhì)形成細(xì)胞成分可作為免疫佐劑參與疾病發(fā)生，并分泌過量的趨化因子和

2、細(xì)胞因子，影響細(xì)胞生長與分化，也可以通過自分泌和旁分泌機(jī)制影響皮膚中其他細(xì)胞，促進(jìn)疾病發(fā)生與發(fā)展。 TRPV1(transient receptor potential vanilloid receptor-1)是TRP家族成員，是一種鈣通道蛋白，人和大鼠的TRPV1已經(jīng)被克隆。最初的研究發(fā)現(xiàn)TRPV1是表達(dá)于外周初級(jí)傳入神經(jīng)元上重要的傷害感受器，參與了急性炎癥痛敏的形成。’rRPVl可以被內(nèi)源性、外源性香草醛類物質(zhì)，熱刺激，酸

3、，炎癥刺激和組織損傷等激活。TRPV1不僅存在于神經(jīng)元細(xì)胞，還廣泛存在于非神經(jīng)細(xì)胞上，例如呼吸道上皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞，膀胱上皮細(xì)胞，胃壁上皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞中TRPV1受體的功能尤其是在皮膚神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的作用受到重視，因此也被看作是開發(fā)抗炎和鎮(zhèn)痛藥物的新的靶點(diǎn)。多種傷害性刺激通過直接誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞，觸發(fā)了表皮的炎癥反應(yīng)，升高了致炎因子和緩激肽等炎癥介質(zhì)的水平。在人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中TRPV1的活化能直接導(dǎo)致環(huán)氧酶．2的釋放

4、。研究發(fā)現(xiàn)，在人的鼻、氣管和肺上皮細(xì)胞中TRPV1在辣椒素(CAP)的作用下活化，能夠介導(dǎo)人上皮細(xì)胞中IL-6基因和蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。說明TRPV1可能在角質(zhì)形成細(xì)胞等非神經(jīng)細(xì)胞分泌炎癥因子參與炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。針對(duì)TRPV1的藥物研究也將為皮膚炎癥性疾病的治療帶來新的前景。 為揭示角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)TRPV1的生物學(xué)功能，我們檢測(cè)了分離的人角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)與TRPV1之間的關(guān)系。同時(shí)還研究了T

5、RPV1活化后細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶檢測(cè)技術(shù)探討了TRPV1活化與NFκB活化的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，考察了臨床用于抗炎鎮(zhèn)痛的皂苷類活性成分對(duì)TRPV1表達(dá)及炎癥介質(zhì)分泌的影響。 主要研究結(jié)果如下： 1．TRPV1mRNA在人角質(zhì)形成細(xì)胞中有表達(dá)，且在CAP刺激下表達(dá)增加。經(jīng)ELISA法檢測(cè)，CAP顯著升高了致炎因子IL-8和PGE2的表達(dá)水平，且呈劑量依賴性。8μmol/L CAP可以使角質(zhì)形成細(xì)胞I

6、L-8顯著升高62.75％，使PGE2升高54.73％。這種作用能夠被TRPV1受體拮抗劑CPZ抑制，說明TRPV1活化促進(jìn)了致炎因子的表達(dá)。 2．經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光探針的方法，發(fā)現(xiàn)2～16μmol/L CAP能劑量依賴性增加HaCaT細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。而3μmol/L CPZ、10μmol/L CPZ和20μmol/L CPZ分別使CAP刺激升高的熒光強(qiáng)度降低了32.11％、38.33％和34.66％。CPZ的抑制作用表明，

7、TRPV1活化導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。 3．經(jīng)流式細(xì)胞儀和western blot方法鑒定，成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)TRPV1蛋白的HEK293T細(xì)胞株。利用該細(xì)胞株研究證實(shí)，TRPV1介導(dǎo)了CAP刺激HEK293T-TRPV1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，主要是細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的結(jié)果。 4．利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶檢測(cè)技術(shù)，將pNFκB和pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞和HEK293T-TRPV1細(xì)胞

8、，比較三種細(xì)胞經(jīng)CAP刺激后NFκB的活化水平。結(jié)果表明CAP能夠顯著增強(qiáng)經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞和HEK293T-TRPV1細(xì)胞中NFκB轉(zhuǎn)錄活性，而HEK293T細(xì)胞中無明顯變化。TRPV1受體拮抗劑能夠抑制CAP誘導(dǎo)NFκB活化的作用，說明TRPV1活化后進(jìn)一步通過信號(hào)的傳遞誘導(dǎo)了NFκB的激活。 5．利用特異性PI3K和MAPK信號(hào)途徑抑制劑，分別阻斷該兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)PD98059、Wortmannin分別使H

9、EK293T-TRPV1細(xì)胞的NFκB轉(zhuǎn)錄活性降低了52.42％、24.52％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，有顯著差異(P＜0.05)。說明TRPV1活化促進(jìn)NFκB激活的作用與MAPK和PI3K信號(hào)傳遞途徑有關(guān)。 6．人參皂苷Rb1能夠顯著降低HaCaT細(xì)胞中CAP誘導(dǎo)的TRPV1 mRNA表達(dá)，抑制對(duì)NFκB的活化作用，使炎癥因子IL-8、1L-6和PGE2的分泌水平分別下降26.72％、38.23％和57.01％。在HEK293T-TRP

10、V1細(xì)胞株中，Rb1能夠顯著降低CAP誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，特異地抑制CAP誘導(dǎo)的NFκB活化。由此可見，Rb1能夠抑制。TRPV1受體而發(fā)揮作用。 7．芍藥苷(PF)能夠顯著降低CAP升高的IL-8、IL-6、PGE2水平，下降了11.39％、51.96％。75.98％。比較PF對(duì)HaCaT。細(xì)胞和HEK293T-TRPV1細(xì)胞株經(jīng)CAP誘導(dǎo)升高的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的干預(yù)作用，表明PF可能存在其他的通道影響鈣離子內(nèi)流，而不是直接與T