MicroRNA層面重塑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提高其定向神經(jīng)元分化的研究.pdf

1、前言
　　脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）在臨床上越來(lái)越多見(jiàn)，是截癱的主要原因之一，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。如何解決脊髓損傷后重新恢復(fù)原來(lái)的功能，成為現(xiàn)在神經(jīng)病學(xué)工作者研究的焦點(diǎn)和難題。脊髓損傷治療方法很多但是效果卻不佳。近期國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞治療脊髓損傷進(jìn)行了研究，但由于神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSC)的來(lái)源主要是胚胎，受到倫理學(xué)和法律的制約，限制了其發(fā)展。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bo

2、nemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)具有來(lái)源豐富、取材簡(jiǎn)單、培養(yǎng)擴(kuò)增容易、可以自體移植及沒(méi)有倫理爭(zhēng)議等優(yōu)勢(shì)，所以仍是未來(lái)的研究熱點(diǎn)。
　　BMSCs移植治療SCI有待解決的問(wèn)題:(1)移植細(xì)胞的數(shù)量有限。(2)免疫排斥，炎癥反應(yīng)及局部缺血缺氧微環(huán)境不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)膠質(zhì)瘢痕的形成阻礙細(xì)胞的遷移和分布。(4)移植的BMSCs定向神經(jīng)元分化率不高。本課題就是圍繞BMSCs定向神經(jīng)元

3、分化展開(kāi)的。干細(xì)胞治療脊髓損傷是一個(gè)涉及多個(gè)方面的復(fù)雜問(wèn)題。干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的調(diào)控機(jī)制是關(guān)鍵問(wèn)題之一。研究人員試圖通過(guò)增強(qiáng)或減弱某些基因和蛋白表達(dá)的方法，增加干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例，但效果不是很理想。近來(lái)的研究表明，microRNA在干細(xì)胞自我更新及其分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。我們認(rèn)為microRNA可能參與了干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的過(guò)程，可能是定向誘導(dǎo)分化的重要靶點(diǎn)。
　　為了提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向神經(jīng)元的分化率，通過(guò)

4、基因芯片技術(shù)比較體外培養(yǎng)的SD大鼠的BMSCs、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元的microRNA表型，找出差異最明顯的microRNA，我們發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞mir-124下調(diào)最為明顯，mir-199a-3p上調(diào)較為明顯，為了在BMSCs過(guò)表達(dá)mir-124，我們構(gòu)建了慢病毒載體pLVX-EN-rno-mir124，感染BMSCs后，獲得了mir-124的過(guò)表達(dá)。對(duì)于轉(zhuǎn)染后的BMSCs，我們通過(guò)免疫熒光，WesternB

5、lot，RT-PCR等方法進(jìn)一證實(shí)了神經(jīng)元細(xì)胞早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達(dá)率在mir-124過(guò)表達(dá)組都顯著升高，而在對(duì)照組沒(méi)有明顯變化。由此我們可以得出結(jié)論:mir-124和mir-199a-3p在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化方面有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定，通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行全譜microRNA微點(diǎn)陣分析，比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干

6、細(xì)胞和神經(jīng)元之間的microRNA表達(dá)差異，挑選1～2條差異最明顯的（包含增高和減弱）microRNA進(jìn)行后續(xù)研究，并用RealTimeRT-PCR及Westernblot法驗(yàn)證這些microRNA的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)一:設(shè)計(jì)rno-mir-124序列，并交由南京金斯瑞公司合成rno-mir-124序列，構(gòu)建到pUC57-simple載體上，用XhoⅠ、BamHⅠ將pUC57-Simple-rno-mir124及目的載體pLVX-E

7、GFP-IRES-neo雙酶切，然后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中。重組質(zhì)粒的純化和提取使用大量質(zhì)粒提取試劑盒。重組質(zhì)粒通過(guò)限制性酶切消化法，瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析技術(shù)鑒定。通過(guò)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，通過(guò)逐級(jí)稀釋法測(cè)定滴度，然后感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后mir-124在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光，WesternBlot等方法進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞

8、早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達(dá)率在mir-124過(guò)表達(dá)組中的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:設(shè)計(jì)下調(diào)rno-mir199a-3p的序列rno-mir199a-3p-sponge，并交由南京金斯瑞公司合成該片段，用XhoⅠ、BamHⅠ將rno-mir199a-3p-sponge片段及目的載體pLVX-EGFP-IRES-neo雙酶切，然后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中。待轉(zhuǎn)化步驟中得到的抗性（請(qǐng)根據(jù)載體抗性選擇）培養(yǎng)基上長(zhǎng)出

9、菌落，選取幾個(gè)較大的周圍沒(méi)有雜菌的白色菌落用牙簽分別挑取，接種至5ml完全培養(yǎng)液內(nèi)，Amp+在培養(yǎng)液中的終濃度為100μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。重組質(zhì)粒通過(guò)限制性酶切消化法，瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析技術(shù)鑒定。通過(guò)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，通過(guò)逐級(jí)稀釋法測(cè)定滴度，然后感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)Western-Blot的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后mir-199a-3p在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒

10、光等方法進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達(dá)率在mir-199a-3p下調(diào)組中的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元的microRNA的表達(dá)。
　　基因芯片技術(shù)及RT-PCR技術(shù)證實(shí)與神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元相比，mir-124的表達(dá)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中下調(diào)最為明顯;mir-199a-3p的表達(dá)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，升高較為明顯。
　　二、成功構(gòu)建及檢測(cè)過(guò)表

11、達(dá)及抑制表達(dá)慢病毒載體
　　1、pLVX-EN-rno-mir-124的構(gòu)建:pUC57-rno-mir124經(jīng)BglⅡ和SalⅠ酶切將得到2.7Kb的載體帶和600bp左右的rno-mir-124條帶，測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建序列與目的序列完全一致，構(gòu)建正確。用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期切出約600bp左右的rno-mir-124片段帶和約8.9kb左右的載體帶。將陽(yáng)性克隆送到長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得的序列

12、和rno-mir-124基因片段序列進(jìn)行比對(duì)，顯示構(gòu)建序列與預(yù)期序列完成一致，pLVX-EN-rno-mir-124構(gòu)建成功。
　　2、pLVX-199a-3p-sponge的構(gòu)建:用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期切出約1kb左右的片段帶（EGFP+rno-mir199a-3P的總大?。┖图s8.0kb左右的載體帶。將陽(yáng)性克隆送到長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得的序列和rno-mir199a-3p-sponge片

13、段序列進(jìn)行比對(duì)，顯示構(gòu)建序列與預(yù)期序列完成一致，pLVX-199a-3p-sponge構(gòu)建成功。
　　三、轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，mir-124表達(dá)上調(diào)，mir-199a-3p表達(dá)下調(diào)。
　　1、mir-124表達(dá)上調(diào)
　　感染293FT細(xì)胞4天后，通過(guò)計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)病毒滴度。結(jié)果顯示根據(jù)熒光圖片中GFP表達(dá)情況，在加入1E-6稀釋度病毒液的整個(gè)孔中觀察到3個(gè)帶熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔中至少有3個(gè)病毒顆粒感

14、染了細(xì)胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，本研究中就是3/2*（1E-6）=1.5E+6，所以滴度為1.5E+9TU/ml，排除操作誤差因素，我們可取滴度為5E+8用于實(shí)驗(yàn)。pLVX-EN-rno-mir124慢病毒感染rBMSCs細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果提示感染后的BMSCs細(xì)胞，mir-124的表達(dá)明顯升高。
　　2.mir-199a-3p表達(dá)下調(diào)
　　感染293FT細(xì)胞4天后，通過(guò)計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白的表達(dá)

15、來(lái)評(píng)價(jià)病毒滴度。結(jié)果顯示根據(jù)熒光圖片中GFP表達(dá)情況，在加入1E-6稀釋度病毒液的整個(gè)孔中觀察到2個(gè)帶熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔中至少有2個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，本研究中就是2/2*（1E-6）=1E+6，所以滴度為1E+9TU/ml，排除操作誤差，我們可取滴度為5E+8用于實(shí)驗(yàn)。Western-Blot結(jié)果提示mir-199a-3p-sponge慢病毒感染BMSCs細(xì)胞后，mir-199a-3

16、p的靶點(diǎn)mTOR的表達(dá)明顯增強(qiáng)，間接證明mir-199a-3p下調(diào)。
　　四、過(guò)表達(dá)mir-124及抑制mir-199a-3p表達(dá)，使β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2及突觸囊泡蛋白的表達(dá)明顯提高。
　　1、過(guò)表達(dá)mir-124的BMSCs
　　β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2作為神經(jīng)元早期的標(biāo)志物，免疫熒光染色顯示與對(duì)照組及mir-124-比較，mir-124+組在體外培養(yǎng)的第六天顯著提高了β-Ⅲ微管蛋白的表達(dá)水平。同樣過(guò)表達(dá)mi

17、r-124，使MAP-2的表達(dá)水平顯著提高。Western-Blot檢測(cè)得到了相同的結(jié)論。突觸囊泡蛋白（Synaptophysin）是位于突觸囊泡上的膜蛋白，在由Ca2+信號(hào)介導(dǎo)的突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和泡吐過(guò)程起著重要的作用，作為突觸特異性標(biāo)志物，Synaptotagmins在科研中被廣泛使用。我們的研究證實(shí)突觸囊泡蛋白的表達(dá)水平，在mir-124+組也是明顯增強(qiáng)的。
　　2、抑制mir-199a-3p的BMSCs
　　免疫熒光染色

18、顯示與對(duì)照組及空白載體組比較，anti-mir-199a-3p組在體外培養(yǎng)的第六天顯著提高了β-Ⅲ微管蛋白的表達(dá)水平。同樣抑制mir-199a-3p，使MAP-2的表達(dá)水平顯著提高。
　　結(jié)論
　　1、載體pLVX-EN-rno-mir-124及pLVX-199a-3p-sponge的成功構(gòu)建。
　　2、慢病毒pLVX-EN-rno-mir-124感染BMSCs細(xì)胞，顯著提高了mir-124的表達(dá)。
　　3、慢病