大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向膠質(zhì)瘤遷移及其時(shí)空分布的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： (1)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)靶向膠質(zhì)瘤遷移的能力。 (2)明確超順磁性氧化鐵納米粒子(SPIO)體外標(biāo)記MSCs的適當(dāng)濃度和不同標(biāo)記濃度對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活性影響。 (3)應(yīng)用1.5T MRI探討MSCs靶向顱內(nèi)膠質(zhì)瘤遷移的分布模式。 (4)探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1a(SDF-1a)在MSCs靶向膠質(zhì)瘤遷移過(guò)程中的作用。 方法： (1)分離

2、培養(yǎng)大鼠MSCs，應(yīng)用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記MSCs，觀察MSCs在體外向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的模式，Transwell系統(tǒng)定量分析MSCs的遷移能力。將LacZ標(biāo)記的MSCs經(jīng)靜脈注入膠質(zhì)瘤苛瘤大鼠體內(nèi)，2 w后取下腦、心臟、肺臟、肝臟和腎臟進(jìn)行x-gal染色觀察MSCs在腦膠質(zhì)瘤苛瘤大鼠的全身分布。 (2)體外不同濃度SPIO標(biāo)記MSCs，觀察不同標(biāo)記濃度細(xì)胞活力的改變及標(biāo)記率，測(cè)量并繪制未標(biāo)記細(xì)胞和標(biāo)記細(xì)胞的MTT生

3、長(zhǎng)曲線，選取適當(dāng)濃度標(biāo)記量。 (3)運(yùn)用SPIO和EGFP雙重標(biāo)記MSCs，靜脈移植雙標(biāo)細(xì)胞后應(yīng)用MRI觀察MSCs在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的時(shí)空分布。普魯士藍(lán)和免疫熒光染色檢測(cè)MSCs靶向顱內(nèi)膠質(zhì)瘤遷移的分布模式。 (4)通過(guò)RT-PCR及流式細(xì)胞儀檢測(cè)第二代MSCs表達(dá)趨化因子受體CCR2和CXCR4的情況；利用Transwell系統(tǒng)探討趨化因子MCP-1和SDF-1a對(duì)MSCs的體外趨化作用；抗體阻斷后觀察其對(duì)MSCs的膠質(zhì)瘤

4、趨向性的影響。 結(jié)果： (1)將轉(zhuǎn)染AAV-EGFP的MSCs與F98膠質(zhì)瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)后，綠色的MSCs聚集于F98克隆中，而在其它部位均不見(jiàn)綠色MSCs的分布。在不同時(shí)間點(diǎn)觀察到MSCs在體外向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的現(xiàn)象，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的綠色MSCs向F98克隆聚集。體外研究顯示正常腦組織溶解物或生理鹽水不能刺激MSCs和成纖維細(xì)胞向其遷移，F(xiàn)98膠質(zhì)瘤溶解物和F98膠質(zhì)瘤細(xì)胞能顯著誘導(dǎo)MSCs向其遷移。單因素方

5、差分析表明不同類型細(xì)胞遷移能力存在顯著不同(F=22.34；P<0.001)，不同刺激因素誘導(dǎo)MSCs的遷移能力也存在顯著的不同(F=7.65；P=0.0002)。MSCs體外遷移能力明顯強(qiáng)于成纖維細(xì)胞；F98膠質(zhì)瘤細(xì)胞和F98膠質(zhì)瘤溶解物較其它刺激因素具有更強(qiáng)的趨化作用。MSCs經(jīng)靜脈移植14 d后，X-gal染色觀察藍(lán)色細(xì)胞很少分布于檢測(cè)器官，而在腦腫瘤中則有大量藍(lán)色的MSCs分布于其中。腦腫瘤內(nèi)的藍(lán)色MSCs(97.52±16.1

6、3/section)顯著高于對(duì)側(cè)正常腦組織(7。64±2.31/section)和其它器官(心臟：O/section；肺臟：3.76±1.74/section；肝臟：9.64±1.55/section；腎臟：19.78±2.63/section；脾臟：5.74±1.98/ection)(P<0.001)。 (2)體外標(biāo)記的MSCs普魯士藍(lán)染色見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)有許多藍(lán)染的鐵顆粒。25μg/ml標(biāo)記組孵育24 h和72 h后，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)

7、數(shù)死細(xì)胞數(shù)約為12％-15％，與未標(biāo)記細(xì)胞(約15％)相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在100μg/ml和250μg/ml標(biāo)記組孵育24h和72h后，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(約57％-78％)明顯低于未標(biāo)記細(xì)胞組(約85％)(P<0.001)。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SPIO標(biāo)記MSCs的增殖活力與未標(biāo)記MSCs相比無(wú)改變。1d，3d，1w和2w時(shí)測(cè)得的OD值比較，兩組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (3)移植7d后，SPIO/EGFP雙標(biāo)細(xì)胞侵入腫瘤中

8、，散布于腫瘤內(nèi)部。14d后，雙標(biāo)細(xì)胞不再分布于腫瘤內(nèi)部，大多數(shù)位于腫瘤和正常腦組織之間沿腫瘤邊界分布。雙標(biāo)MSCs不僅分布于侵入邊緣或腫瘤內(nèi)部，并能夠追蹤浸潤(rùn)正常腦組織的腫瘤細(xì)胞。1.5 TMRI掃描發(fā)現(xiàn)，雙標(biāo)細(xì)胞經(jīng)靜脈移植7d后，腫瘤內(nèi)部呈現(xiàn)一小片界限清晰的低信號(hào)暗區(qū)，而在移植未標(biāo)記細(xì)胞的對(duì)照組則沒(méi)有信號(hào)改變。14d后，在腫瘤的邊緣呈現(xiàn)為不連續(xù)的弧形低信號(hào)。MRI顯像所示低信號(hào)區(qū)與組織切片普魯士藍(lán)染色相符合。 (4)MSCs表

9、達(dá)趨化因子受體CCR2和CXCR4；當(dāng)MCP-1濃度為4、20 nh/ml時(shí)，MSCs的遷移數(shù)量較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)，100、500ng/ml組較對(duì)照組無(wú)顯著性差異。SDF-1a誘導(dǎo)MSCs的趨化作用呈劑量依賴關(guān)系，在100 ng/ml濃度時(shí)達(dá)高峰；抗MCP-1抗體或抗CXCR4抗體顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)MSCs的趨化作用。 結(jié)論： (1)MSCs具有高度特異性地向膠質(zhì)瘤遷移的能力。 (2