人清道夫受體AⅡ（SR-AⅡ）胞外部分在畢赤酵母的分泌表達及其拮抗劑篩選模型的構建研究.pdf

1、在現代社會各種疾病中,心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均居前列,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是其主要病理基礎.巨噬細胞上清道夫受體A(Macrophage Scavenger Receptor A,SR-A,亦被稱為MSR1)是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程的重要參與者,可無限制攝取修飾低密度脂蛋白(modified low densitylipoprotein,mLDL),其攝取不存在負反饋機制,形成泡沫細胞,最終出現動

2、脈粥樣硬化病灶.因此SR-A被認為是發(fā)現新型心血管藥物的潛在靶位,抑制SR-A活性的化合物有望成為治療動脈粥樣硬化的候選藥物.使用200 nM PMA誘導THP-1細胞4天,THP-1細胞分化為巨噬細胞,提取其總RNA.應用兩步法RT-PCR擴增得到編碼人Ⅱ型SR-A胞外部分(shSR-AⅡ)的cDNA片段,克隆至pGEM-T載體,測序結果表明DNA序列與文獻報道一致.將此片段克隆至巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表

3、達載體pPIC9K中,構建重組表達質粒p9K-shSR-AⅡ.U937泡沫細胞模型進一步表明shSR-AⅡ可通過競爭性結合oxLDL阻止巨噬細胞攝取oxLDL,從而抑制泡沫細胞形成,為以shSR-AⅡ為靶點建立抗動脈粥樣硬化藥物篩選模型奠定了基礎.同時初步研究了重組菌株在不同發(fā)酵條件下的分泌表達情況.以受體-配基競爭性結合的原理為基礎,通過對各種條件的優(yōu)化,包括采用硫酸銨分級沉淀方法,初步分離純化shSR-AⅡ;配基oxLDL的包被液等

4、,以重組shSR-AⅡ建立了SR-A拮抗劑篩選模型.應用模型對560個化合物、220個微生物發(fā)酵液及320個微生物發(fā)酵液丙酮提取物進行了初步篩選,初篩陽性率為1.0%.對初篩陽性化合物進行了進一步篩選,得到3個陽性化合物,具有濃度依賴抑制效應,U937泡沫細胞模型顯示其中2個陽性化合物可明顯抑制泡沫細胞形成.本研究首次利用巴斯德畢赤酵母分泌表達shSR-AⅡ;并以受體-配基競爭性結合為基礎,利用重組shSR-AⅡ建立了拮抗劑高通量篩選模