2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩72頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpes virus disease,KHVD)是危害養(yǎng)殖鯉最為嚴重的病毒性疾病,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報的疾病,我國將其列為二類動物疫病。KHV具有高度傳染性,毒力強,感染錦鯉、鯉及其普通變種。目前KHV的檢測方法大都需要昂貴的儀器設(shè)備,且操作復(fù)雜,需要專業(yè)技術(shù)人員操作,不能滿足現(xiàn)場快速診斷的要求。因此,目前亟需建立一種操作簡單、結(jié)果準確可靠、結(jié)果判定直觀、成本低廉的現(xiàn)場快速檢測方法,為疾

2、病的防控提供技術(shù)支撐。本論文對錦鯉皰疹病毒病的國內(nèi)外流行現(xiàn)狀、檢測方法以及交叉引物技術(shù)的原理和應(yīng)用等進行了闡述,研究與建立了一種與膠體金標記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合的錦鯉皰疹病毒單交叉引物等溫擴增的可視化檢測方法。
  本論文研究的主要內(nèi)容如下:
  1.引物設(shè)計及病毒DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,設(shè)計了一組

3、單交叉擴增引物,包括交叉引物2a1s,探針引物2 a(2a-Bio)、3a(3a-FIT),剝離引物4s、5 a。利用錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin培養(yǎng)增殖KHV,提取病毒基因組DNA。以4s、5a為引物和KHV基因組DNA為模板擴增KHV Sph基因的部分片段,然后將該基因片段克隆連接 pMD?-19T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD?-19T-Sph,作為后續(xù)實驗的標準DNA模板。
  2.建立交叉引物等溫擴增(cross primi

4、ng amplification,CPA)的基礎(chǔ)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,并對其進行了優(yōu)化,最終建立了KHV單交叉引物等溫擴增(single cross priming amplification,SCPA)KHV-SCPA方法。本實驗依次優(yōu)化了引物濃度比例、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、Bst DNA聚合酶用量以及反應(yīng)溫度和擴增時間。最佳反應(yīng)體系各成分終濃度為:1×ThermoPol? Reaction Buffer,交

5、叉引物2a1s1.0μmol/L,探針引物2a(2a-Bio)、3a(3a-FIT)各0.5μmo l/L,剝離引物4s、5a各0.6μmol/L,Mg2+濃度8.0 mmol/L,dNTPs濃度1.2 mmol/L,Betaine濃度0.7 mol/L,Bst DNA聚合酶用量5.6 U,模板DNA1μL,無核酸酶水補足至25μL。最佳反應(yīng)溫度為63℃,最佳擴增時間為60 min,擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶。
  3.KHV

6、-SCPA特異性檢測及靈敏度測定。提取錦鯉皰疹病毒KHV、鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鰻鱺皰疹病毒(AngHV)、大鯢虹彩病毒(GSIV)、白斑綜合征病毒(WSSV)以及細菌病原嗜水氣單胞菌(Ah)基因組DN A,進行特異性檢測實驗,結(jié)果表明,KHV-SCPA檢測方法可特異性檢測出KHV。將常規(guī)PCR的檢測靈敏度與本研究建立的KHV-SCPA檢測靈敏度進行比較,結(jié)果表明,KHV-SCPA檢測方法靈敏度較之常規(guī)PCR法高出約1000倍

7、。與膠體金標記的核酸快速檢測試紙條相結(jié)合,在3~5min內(nèi)可對等溫擴增反應(yīng)產(chǎn)物進行可視化檢測。
  綜上所述,本研究建立的KHV-SCPA檢測方法可在63℃下60 min內(nèi)實現(xiàn)DNA擴增,特異性地檢測出KHV,靈敏度較之常規(guī)PCR方法高出約1000倍。結(jié)合核酸試紙條檢測技術(shù),在3~5 min內(nèi)可對反應(yīng)產(chǎn)物進行可視化檢測。KHV-SCPA檢測方法不依賴昂貴的儀器設(shè)備與專業(yè)技術(shù)人員,可應(yīng)用于錦鯉皰疹病毒的現(xiàn)場快速檢測中,為錦鯉皰疹病毒

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論