TM4基因通過(guò)Nur77-IKKβ-NF-kB通路抑制高脂誘導(dǎo)的代謝性炎癥.pdf

1、第一部分 TM4基因真核表達(dá)載體及慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:分別構(gòu)建人四穿膜(TM4)基因與小鼠TM4基因的真核表達(dá)載體，及其慢病毒表達(dá)載體，為下一步TM4基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1)分別以人TM4質(zhì)粒、小鼠cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出人TM4基因[TM4(h）]與小鼠TM4基因[TM4(m)]的開(kāi)放閱讀框(ORF);
　　2)將TM4(h)、TM4(m)基因克隆到真核表達(dá)載體pc

2、DNA中，并用酶切、測(cè)序證實(shí)插入的基因序列的正確性;
　　3)進(jìn)一步用pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK93細(xì)胞，RT-PCR以及westrn-blot方法證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功并且能夠正確表達(dá)TM4;
　　4)分別以慢病毒包裝TM4(h)、TM4(m)表達(dá)載體，并經(jīng)293TN細(xì)胞感染證實(shí)病毒包裝成功;
　　5)收集細(xì)胞上清，用梯度稀釋法檢測(cè)病毒滴度。用TM4(h)、TM4(m)慢病毒分別感染T

3、HP-1細(xì)胞與3T3-L1細(xì)胞，確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)值。
　　結(jié)果:
　　1)成功構(gòu)建TM4(h)、TM4(m)的真核表達(dá)載體pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m)，經(jīng)鑒定證實(shí)序列正確，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以正確表達(dá)TM4蛋白。
　　2)成功包裝表達(dá)TM4(h)、TM4(m)基因的重組慢病毒載體，經(jīng)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)病毒包裝成功。
　　3)細(xì)胞上清液中的TM4(h)病毒滴度為1.56×104 ifu/u

4、l，TM4(m)病毒滴度為1.67×104 ifu/ul。
　　4)慢病毒感染THP-1細(xì)胞與3T3-L1細(xì)胞的最佳MOI值分別為8與18.4。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建TM4(h)、TM4(m)真核表達(dá)載體及重組慢病毒載體。能在293TN細(xì)胞中正確表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 TM4負(fù)調(diào)控Nur77-IKKβ-NF-kB通路并能抑制高脂誘導(dǎo)的代謝性炎癥
　　目的:研究TM4對(duì)Nur77-IKKβ-NF-

5、kB通路以及高脂誘導(dǎo)的慢性炎癥的影響。
　　方法:
　　1)按照之前確立的最佳MOI，用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的TM4(h)、TM4(m)重組慢病毒分別感染THP-1與3T3-L1細(xì)胞，兩種細(xì)胞分別設(shè)立空病毒感染及空白對(duì)照。
　　2)用終濃度1mM的軟脂酸及油酸混合物(1∶1)分別處理已感染慢病毒的THP-1與3T3-L1細(xì)胞。
　　3)采用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)TM4

6、、Nur77、IKKβ、NF-kB p65在mRNA與蛋白水平的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1)慢病毒感染后961h，有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)接近細(xì)胞總數(shù)的100％。Real-time PCR及Western blot檢測(cè)顯示，感染TM4重組慢病毒后，TM4基因明顯上調(diào);
　　2) Real-time PCR及Western blot檢測(cè)顯示，對(duì)于THP-1細(xì)胞及3T3-L1細(xì)胞，高脂均能下調(diào)TM4表達(dá)，激活Nur7

7、7、IKKβ、NF-kB p65、TNF-α等炎癥基因;
　　3)TM4過(guò)表達(dá)，可明顯下調(diào)Nur77、IKKβ、NF-kB p65、TNF-α的mRNA水平及其蛋白表達(dá)，抑制高脂誘導(dǎo)的炎癥激活。
　　結(jié)論:TM4能負(fù)調(diào)控Nur77-IKKβ-NF-kB通路，抑制高脂誘導(dǎo)的代謝性炎癥激活。
　　第三部分 TM4過(guò)表達(dá)能改善高脂喂養(yǎng)db/db小鼠的代謝性炎癥與胰島素抵抗
　　目的:觀察過(guò)表達(dá)TM4基因后db/db小鼠

8、的表型變化。
　　方法:將2周齡的雄性db/db小鼠30只隨機(jī)分為3組（生理鹽水、空病毒、TM4慢病毒)，每組10只，喂以高脂飼料。3組小鼠每周經(jīng)尾靜脈分別注射生理鹽水、空病毒、TM4慢病毒1次，每次1ml，病毒液濃度為1×104 ifu/ul。每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重、進(jìn)食量、空腹血糖、尾動(dòng)脈血壓變化。飼養(yǎng)10周后(12周齡)，腹腔注射葡萄糖檢測(cè)小鼠糖耐量(IPGTT)，次日將小鼠麻醉處死，取血檢測(cè)血脂、空腹胰島素、炎癥因子;取骨骼肌

9、、肝臟、附睪脂肪組織，行Real-time PCR及Western blot檢測(cè)TM4及其下游Nur77-IKKβ-NF-kB炎癥通路表達(dá)水平，甲醛固定石蠟包埋觀察肝臟與附睪脂肪組織病理變化。
　　結(jié)果:
　　1) Real-time PCR及Western blot顯示:感染TM4(m)慢病毒的小鼠骨骼肌、肝臟、附睪脂肪組織中的TM4表達(dá)均明顯上調(diào);
　　2)慢病毒干預(yù)10周后，TM4過(guò)表達(dá)組db/db小鼠的HOMA

10、-IR、空腹血糖、空腹胰島素、體重、收縮壓、平均壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平顯著低于對(duì)照組，而進(jìn)食量無(wú)顯著差異;
　　3)糖耐量試驗(yàn)顯示:TM4過(guò)表達(dá)小鼠的0min，30min，60min,120min血糖及IPGTT曲線下面積均顯著低于對(duì)照組;
　　4)組織HE染色顯示:對(duì)照及空病毒組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成，呈明顯脂肪肝表現(xiàn)，而TM4過(guò)表達(dá)組肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯氣球樣變;TM4過(guò)表達(dá)組小鼠的附睪脂肪細(xì)胞體積