去泛素化酶CYLD對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎系膜細(xì)胞NF-KB炎癥信號(hào)的調(diào)控研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病特有而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是西方國(guó)家終末腎病(end stage renal defailure，ESRD)產(chǎn)生并最終依靠腎透析維持生命的主要原因。大量研究顯示，在糖尿病腎病早期腎組織中即見到單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、核因子κ出(NF-κB)等炎癥因子產(chǎn)生增加，提示糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與炎癥有密切關(guān)聯(lián)，而NF-κB在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。在所有炎癥反應(yīng)中均可以發(fā)現(xiàn)N

2、F-κB活性增高，當(dāng)抑制其活性以后炎癥的病理過程則被阻止。我們前期研究已證實(shí)了泛素化修飾在對(duì)高糖誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)的活化中有重要調(diào)節(jié)作用。然而NF-κB信號(hào)的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，泛素化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，NF-κB信號(hào)通路也受到去泛素化修飾的調(diào)節(jié)。在眾多調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)去泛素化酶中，去泛素化酶圓柱瘤蛋白(cylindromatosis，CYLD)是NF-κB信號(hào)的主要負(fù)性調(diào)控因子和炎癥抑制因子之一。目前有關(guān)CYLD與糖尿病腎病的研究卻

3、鮮有報(bào)道。為此，本研究首先通過觀察高糖刺激后小鼠腎系膜細(xì)胞CYLD、總IKBα、p-IKBα、p-NF-κB p65、IKKγ、MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)變化，然后分別沉默和過表達(dá)CYLD基因，檢測(cè)高糖誘導(dǎo)的NF-κB通路中總的IKBα、p-IKBα、IKKγ、p-NF-κB p65及下游炎癥因子MCP-1、IL-6、IL-8的表達(dá)，探討去泛素化酶CYLD在糖尿病腎病NF-KB信號(hào)通路激活中的調(diào)控作用。
　　方法:(1)細(xì)

4、胞培養(yǎng)及分組:體外培養(yǎng)小鼠腎系膜細(xì)胞，以高糖作為刺激因子，再分別沉默及過表達(dá)CYLD基因，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)為:1.正常對(duì)照組（NC組）:培養(yǎng)基含葡萄糖5.6mmol/L;2.高糖干預(yù)組（HG1、HG2、和HG3組）:培養(yǎng)基含葡萄糖濃度分別為10、20、30 mmol/L;3.甘露醇組（OP組）:含5.6mmol/L葡萄糖以及24.4mmol/L的甘露醇保持總滲透壓在30mmol/L;4.CYLD SiRNA干擾組:培養(yǎng)基內(nèi)含100nmol/L

5、CYLD SiRNA干擾序列;5.CYLD過表達(dá)組:培養(yǎng)基內(nèi)含過表達(dá)CYLD目的基因的滴度為1*108 TU/ml，MOI值為50的慢病毒;6.空載體組:培養(yǎng)基內(nèi)含不帶有CYLD目的基因的滴度為1*108 TU/ml，MOI值為50的陰性對(duì)照病毒CON235。(2)各組分別作用6h、12h、24h、48h、72h后用蛋白免疫印跡、RT-PCR法檢測(cè)CYLD、總IκBα、p-NF-κBp65、p-IκBα、IKKγ表達(dá)，用ELISA法檢測(cè)

6、NF-κB下游炎癥因子MCP-1、IL-6、IL-8的表達(dá)水平。(3)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）來(lái)表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、與NC組比較，高糖刺激使各組系膜細(xì)胞的CYLD、總量IκBα蛋白和mRNA表達(dá)減弱(P＜0.05)，而p-IκBα、p-NF-κB p65和MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)且具有

7、時(shí)間、濃度依賴性;2、高糖刺激對(duì)IKKγ蛋白和mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響(P＞0.05);3、使用SiRNA干擾CYLD，再用高糖刺激后，IκBα總蛋白表達(dá)進(jìn)一步減弱，而p-Iκ Bα、p-NF-κB p65和MCP-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。4、過表達(dá)CYLD慢病毒轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞，再用高糖刺激后Iκ Bα總蛋白表達(dá)水平增高，信號(hào)分子p-IκBα、p-NF-κB P65蛋白和MCP-1、IL-6、IL-8表達(dá)減弱，提示CYLD在高糖狀態(tài)下可負(fù)性調(diào)