HPD、NLK調(diào)控NF-kB通路和TGFβ通路及機(jī)制研究.pdf

1、本論文包括兩部分內(nèi)容,一是羥苯丙酮酸二加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)正調(diào)控NF-κB通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞存活和遷移。二是NLK通過(guò)Smad4抑制TGFβ信號(hào)通路活性。
　　中國(guó)有句成語(yǔ):物以類(lèi)聚,人以群分。在生物學(xué)研究中也適用這樣的準(zhǔn)則。功能相關(guān)的蛋白質(zhì)通常以相互聯(lián)系的方式調(diào)節(jié)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。因此,蛋白質(zhì)相互作用是發(fā)現(xiàn)未知蛋白功能或已知蛋白質(zhì)新功能的重要手段。我們實(shí)驗(yàn)室前期利用酵

2、母雙雜交技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建了大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)了大量新的蛋白質(zhì)間相互作用[1]。這個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)為我們提供了很多線(xiàn)索和提示。本課題選取該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)的可能具有重要生物學(xué)意義的兩對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用—HPD與NEMO和NLK與Smad4進(jìn)行了深入研究。
　　HPD是酪氨酸分解代謝途徑的關(guān)鍵酶[2]。NEMO是NF-κB信號(hào)通路的核心分子[3]。采用外源和內(nèi)源免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)我們驗(yàn)證了HPD與NEMO的相互作用,確定HPD通過(guò)

3、N端與NEMO的N端發(fā)生相互作用,并證明HPD可能與IKK組成蛋白質(zhì)復(fù)合體。過(guò)表達(dá)HPD加速I(mǎi)κBα的降解,促進(jìn)NF-κB報(bào)告基因活性,增加TNFα誘導(dǎo)的NF-κB靶基因BCL-xL、cIAP2、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá);利用RNAi敲低HPD表達(dá)則抑制NF-κB報(bào)告基因的活性;HPD酶活性突變不影響HPD調(diào)節(jié)NF-κB通路的作用,HPD的催化底物-羥苯丙酮酸(HPP)和催化產(chǎn)物-尿黑酸(HGA)對(duì)NF-κB通路也無(wú)影響。這些結(jié)

4、果說(shuō)明HPD以不依賴(lài)酶活性的方式正調(diào)控NF-κB通路。機(jī)制上,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HPD可以增強(qiáng)TNFα刺激引起的NEMO泛素化修飾。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HPD在小鼠各器官組織的表達(dá),結(jié)果顯示HPD僅在肝臟和腎臟表達(dá),這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。有意義的是,檢測(cè)多種細(xì)胞系中HPD的表達(dá),發(fā)現(xiàn)除肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞系外,多株肺癌細(xì)胞中也表達(dá)HPD。為進(jìn)一步驗(yàn)證HPD在肺癌組織中的表達(dá)及與NF-κB活性的關(guān)系,我們利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了HPD及

5、磷酸化p65(S276)在肺癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)HPD在肺癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率都顯著高于癌旁肺組織,并與磷酸化p65(S276)的表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步,利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi敲低肺癌細(xì)胞A549和H1299的HPD表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPD下調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖沒(méi)有明顯影響,但克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低HPD顯著抑制了肺癌細(xì)胞的克隆形成能力和遷移能力。綜上,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HP

6、D在肺癌組織中異常表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可減低肺癌細(xì)胞的惡性表型,機(jī)制上可能與HPD通過(guò)與NEMO的相互作用,以不依賴(lài)酶活性的方式激活NF-κB通路有關(guān),提示HPD可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　NLK是一種保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,識(shí)別的保守序列為S/TP基序,通過(guò)磷酸化底物的方式參與多種生物學(xué)過(guò)程[5-9]。采用免疫共沉淀和GSTpulldown我們證明NLK能與Smad4發(fā)生相互作用。進(jìn)一步,我們初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLK以