NF-kB信號(hào)通路在RU486誘導(dǎo)小鼠月經(jīng)模型月經(jīng)發(fā)生早期過(guò)程中的作用.pdf

1、孕酮撤退引發(fā)子宮內(nèi)膜發(fā)生一系列的生物學(xué)事件導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生周期性的剝脫和崩解即月經(jīng),它是人和部分靈長(zhǎng)類動(dòng)物和少數(shù)其它動(dòng)物(如蝙蝠)所特有的生理現(xiàn)象。解析子宮內(nèi)膜周期性的崩解出血機(jī)制是理解異常出血和發(fā)現(xiàn)應(yīng)對(duì)策略的關(guān)鍵所在,對(duì)女性生殖健康具有重要意義。但是孕酮撤退和內(nèi)膜崩解脫落之間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路遠(yuǎn)未明確,孕酮撤退究竟導(dǎo)致下游被調(diào)控基因發(fā)生哪些變化還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有清楚,其中一個(gè)重要原因就是沒(méi)有合適的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)利用RU486拮抗孕酮撤退建立小鼠

2、月經(jīng)模型的基礎(chǔ)上,對(duì)月經(jīng)發(fā)生機(jī)制進(jìn)行一些探討。
　　 關(guān)于月經(jīng)發(fā)生機(jī)制研究表明孕酮撤退是月經(jīng)發(fā)生的始動(dòng)因素,早期研究可以歸納為血管收縮、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理反應(yīng),進(jìn)而最終引起MMPs系統(tǒng)降解間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì),從而導(dǎo)致組織的崩解脫落。因?yàn)镹F-κB是和炎癥、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,推測(cè)NF-κB在月經(jīng)發(fā)生過(guò)程中起重要作用,進(jìn)而在小鼠月經(jīng)模型過(guò)程驗(yàn)證這個(gè)推論,這對(duì)于解析月經(jīng)的發(fā)生機(jī)制具有十分重要的意義。對(duì)此我們進(jìn)行了一些有

3、益的探索,結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)western blot技術(shù)首先從整體動(dòng)物的水平證實(shí)了孕酮撤退后,上調(diào)了NF-κBp50,p65核蛋白中的表達(dá)量并在12h表達(dá)量達(dá)到最大,激活了NF-κB信號(hào)通路。并進(jìn)一步證實(shí)了,孕酮撤退后,可能通過(guò)NIK-IKKβ-IκBα上游信號(hào)通路激活NF-κB；同時(shí)利用免疫熒光的方法在細(xì)胞水平證實(shí)了,在原代培養(yǎng)小鼠蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞模擬孕酮撤退后16h,NF-κB p50和p65入核,即激活NF-κB。<

4、br>　　 2.選擇了NF-κB下游信號(hào)分子-MMP家族主要成員MMP1、MMP3、MMP9、MMP10以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)作為研究的靶分子,從蛋白表達(dá)定位、mRNA、蛋白三個(gè)水平,以及從整體模型整體動(dòng)物、小鼠蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞、原代培養(yǎng)的人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞三個(gè)層次比較并探討了RU486拮抗孕酮激活的NF-κB對(duì)對(duì)這些信號(hào)分子的影響。結(jié)果表明:
　　 (1)在小鼠模型和蛻膜化小鼠基質(zhì)細(xì)胞中,通過(guò)real-time PC

5、R和western blot技術(shù)驗(yàn)證孕酮撤退后上調(diào)了MMP-13、MMP-3、MMP-9、MMP-10、COX2的mRNA和蛋白的表達(dá),并在撤退后16h,達(dá)到峰值。同時(shí)下調(diào)了MMP-7的表達(dá)。
　　 (2)在原代培養(yǎng)的人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化模擬孕酮撤退,也上調(diào)這些信號(hào)分子mRNA表達(dá),但峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同,MMP—1、MMP-9、MMP-10、COX-2在孕酮撤退4d達(dá)到峰值,MMP-3在孕酮撤退2d達(dá)到峰值。從免疫組化

6、水平,說(shuō)明了MMP-1(13)/3/9/10和COX-2在月經(jīng)發(fā)生過(guò)程中,共定位于即將脫落的基底層區(qū)域基質(zhì)細(xì)胞,這種空間和時(shí)間上的一致性表明了受NF-κB直接調(diào)控的這些信號(hào)分子參與了內(nèi)膜組織的崩解過(guò)程。
　　 3.利用NF-κB抑制劑PDTC從整體動(dòng)物水平觀察到部分抑制了子宮內(nèi)膜的崩解。從分子機(jī)制,觀察到MMP-1/3/9/10、COX-2的mRNA的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)和。NF—κB的激活和抑制是一致的。同時(shí)應(yīng)用CHIP的方法驗(yàn)證

7、了孕酮撤退后,募集NF—κB p65綁定在MMP-9和COX-2的啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)MMP-9和COX-2的表達(dá)。在蛻膜化小鼠基質(zhì)細(xì)胞和人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中,通過(guò)NF-κB抑制劑MG-132在細(xì)胞水平阻斷NF—κB信號(hào)通路,也觀察到這些效應(yīng)因子相似的調(diào)控方式。
　　 4.觀察發(fā)現(xiàn)在孕酮維持72h后,子宮內(nèi)膜依然發(fā)生崩解,并從蛋白水平發(fā)現(xiàn)NF-κB同時(shí)被激活,但其下游調(diào)控基因MMP-9和COX-2未發(fā)生變化,更進(jìn)一步說(shuō)明了NF-κB在