NEMO在T細(xì)胞受體介導(dǎo)的NF-kB信號通路中的抑制作用.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi),能與多種蛋白基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程。近年來關(guān)于TCR誘導(dǎo)NF-κB激活的機(jī)制已經(jīng)取得很多突破,但I(xiàn)KK復(fù)合體的激活機(jī)制仍不明確,IKK復(fù)合體調(diào)節(jié)亞基NEMO的調(diào)節(jié)機(jī)制同樣存在許多未知。
　　 為研究NEMO在TCR誘導(dǎo)NF-κB信號通路激活過程中的確切功能和機(jī)制,本研究利用RNA干擾技術(shù),

2、構(gòu)建了穩(wěn)定干擾NEMO的Jurkat T細(xì)胞系si-NEMO,并以其為研究對象,結(jié)合IκBα降解、p65入核及NF-κB報(bào)告基因的研究結(jié)果,闡述了NEMO在TCR誘導(dǎo)經(jīng)典NF-κB激活過程中發(fā)揮的作用及特異性；通過分析NEMO和IKKβ等蛋白在細(xì)胞亞組份中的分布,進(jìn)一步研究了NEMO在TCR/NF-κB激活過程中的作用機(jī)制；另外,本研究還對NEMO SUMO化修飾與TCR誘導(dǎo)NF-κB通路激活的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。
　　 主要研

3、究結(jié)果如下:
　　 (1)TCR刺激能夠更快更徹底地誘導(dǎo)si-NEMO細(xì)胞中IκBα的降解,同時(shí)也顯著增強(qiáng)p65入核和NF-κB報(bào)告基因的活性,但MAPKs的激活不受影響。Jurkat E6.1細(xì)胞中超表達(dá)NEMO能夠顯著抑制基礎(chǔ)和TCR誘導(dǎo)的NF-κB活性,而與Jurkat E6.1相比,si-NEMO細(xì)胞在靜息狀態(tài)和刺激條件下的增殖明顯增強(qiáng)。提示內(nèi)源NEMO對于TCR誘導(dǎo)經(jīng)典NF-κB信號通路的激活可能具有抑制作用。

4、　　 (2)與TCR刺激結(jié)果相反,在si-NEMO細(xì)胞中,LPS和TNF-α誘導(dǎo)的IκBα降解均受到顯著抑制,表明NEMO可能特異性地抑制TCR介導(dǎo)NF-κB信號通路的激活。
　　 (3)細(xì)胞亞組分分離實(shí)驗(yàn)證實(shí),與Jurkat E6.1和NC細(xì)胞相比,在si-NEMO細(xì)胞中,TCR誘導(dǎo)PKCθ在細(xì)胞膜及脂筏上的聚集狀況無明顯差異,但Bcl10、TRAF-6、IKKβ在細(xì)胞膜尤其是脂筏上的聚集量均有明顯增加,其中IKKβ在脂筏上

5、迅速且持續(xù)聚集動(dòng)態(tài)地對應(yīng)IκBα的迅速持續(xù)降解,說明IKKβ在脂筏上迅速而持續(xù)的聚集對于TCR/NF-κB信號通路起到主要作用:而TRAF-6脂筏上聚集量的顯著增加對于TCR誘導(dǎo)si-NEMO細(xì)胞中NF-κB的持續(xù)激活可能起到重要作用。TCR刺激T細(xì)胞后,內(nèi)源及外源超表達(dá)的NEMO主要轉(zhuǎn)位到細(xì)胞脂筏上,提示NEMO通過快速而持續(xù)的脂筏轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)對TCR/NF-κB信號通路的抑制作用。
　　 (4)TCR誘導(dǎo)T細(xì)胞后,檢測細(xì)胞中Bc