自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)修飾前炎癥應(yīng)答介導(dǎo)腦型瘧疾的發(fā)生.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 瘧疾感染是當(dāng)今威脅人類健康的主要難題之一,每年有一百多萬(wàn)兒童死于瘧疾。腦型瘧疾(cerebral malaria,CM),簡(jiǎn)稱腦瘧,是瘧疾最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,而且是瘧疾感染的主要死因。CM嚴(yán)重性的決定因素尚不完全清楚,但很可能來(lái)自宿主和寄生蟲兩方面。最終,寄生蟲和免疫應(yīng)答的相互作用決定宿主感染結(jié)局。因此,關(guān)于CM發(fā)生免疫機(jī)制的基礎(chǔ)研究是研制有效抗瘧疫苗和藥物的前提。
　　 伯氏瘧原蟲(Plasmodium

2、 berghei ANKA,P.bANKA)鼠瘧與人類疾病有許多共同特征,是現(xiàn)有CM的最佳模型。目前研究認(rèn)為CM是由腦血管內(nèi)感染紅細(xì)胞(parasitized red blood cells,pRBC)粘附和細(xì)胞因子及效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的強(qiáng)烈的宿主前炎癥應(yīng)答的結(jié)合效應(yīng)引起的疾病。相關(guān)研究表明活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答參與疾病誘導(dǎo),并且CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均可促進(jìn)腦病變發(fā)生。事實(shí)上,Th1應(yīng)答在控制蟲血癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,同時(shí)也促進(jìn)CM

3、發(fā)生。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)是不同于Th1和Th2的具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的T細(xì)胞亞群。Tregs活化是寄生蟲逃避宿主免疫的機(jī)制之一。前期試驗(yàn)已證明Tregs活化與約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii 17XL,P.yoelii 17XL)感染鼠的易感性相關(guān),Tregs可通過(guò)修飾樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)應(yīng)答,誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生和C

4、D4+T細(xì)胞凋亡調(diào)控Th1應(yīng)答。為此本研究動(dòng)態(tài)觀察了正常感染鼠及Tregs消除鼠前炎性細(xì)胞因子,抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平和Tregs增殖變化,以期闡明Tregs在腦瘧發(fā)生中的作用地位及其相關(guān)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建及CM病變?cè)u(píng)估
　　 6-8w,雌性C57BL/6經(jīng)腹腔感染1x106P.bergheiANKA寄生的紅細(xì)胞(pRBC)構(gòu)建CM易感模型,感染BALB/c和DBA/2鼠構(gòu)建CM抵

5、抗模型。實(shí)驗(yàn)組(6只/組)和對(duì)照組(6只/組)小鼠于感染前1d和感染后1d分別經(jīng)腹腔注射1mganti-CD25mAb(7D4,rat IgM；Bio Express)和等體積phosphate-buffered saline(PBS)構(gòu)建Tregs消除小鼠模型。感染后6天起每日監(jiān)測(cè)鼠兩次,評(píng)價(jià)臨床實(shí)驗(yàn)?zāi)X瘧(Experimental cerebral malaria,ECM)癥狀,用以下癥狀確定ECM得分:皮毛豎起、顫抖、肢體癱瘓、痙攣

6、、昏迷。每出現(xiàn)一個(gè)癥狀給予1分,累計(jì)得分≥4分者考慮為重型瘧疾。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞懸液中CD4+T細(xì)胞群內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分含量
　　 分別于感染前和感染后第3d、5d、8d常規(guī)無(wú)菌取出小鼠脾臟,用0.17mol/LNH4Cl裂解紅細(xì)胞,以含10％胎牛血清(Fetal calf serum,FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1 x107/ml。每份樣品用FITC-con

7、jugated anti-mouse CD4/L3T4(GK1.5；BD Pharmingen),APC-conjugated anti-mouse CD25/IL-2 receptor alpha(PC61；BDPharmingen)和PE-conjugated anti-Foxp3(clone FJK16s；eBioscience)進(jìn)行三色分析,另設(shè)陰性對(duì)照管。在流式細(xì)胞儀專用染色管中加入新鮮制備的1x107/ml脾細(xì)胞懸液0.1m

8、l,并用FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育以阻斷熒光抗體的非特異染色,再加入抗CD4-FITC和抗CD25-APC mAb進(jìn)行表面染色,固定透膜后,用抗Foxp3-PE mAb進(jìn)行胞漿內(nèi)染色,用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μlPBS中,流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,USA)進(jìn)行檢測(cè)。以前向和側(cè)向散射角確定淋巴細(xì)胞群,CD4+T細(xì)胞畫門,分析計(jì)算CD4+T細(xì)胞群CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分率。

9、　　 3、采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及Griess方法檢測(cè)NO2-含量
　　 (1)脾細(xì)胞樣品制備分別于感染前和感染后第3d,5d,8d常規(guī)無(wú)菌取出小鼠脾臟,用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％FCS的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1 x107/ml,于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入500μl脾細(xì)胞懸液于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)48h

10、。需要注意的是天然脾細(xì)胞與純化NA/LE hamster anti-mouse CD3e(145-2C11,BD Pharmingen,0.56μl/well)和純化NA/LE hamster anti-mouse CD28(37.51,BD Pharmingen,0.112μl/well)于37℃,5％CO2條件下共同培養(yǎng)48h以刺激IL-17產(chǎn)生,隨后收集培養(yǎng)上清,-80℃保存,待細(xì)胞因子及NO檢測(cè)。
　　 (2)雙抗體夾心

11、ELISA試劑盒分別檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17的分泌水平,酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析,計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 (3)Griess方法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO2-含量100μl上清和Griess反應(yīng)液100μl室溫反應(yīng)10min,用NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品,酶標(biāo)儀檢測(cè)550nm處O

12、D值。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、感染率、幸存率與疾病評(píng)估
　　 腦瘧是通過(guò)給C57BL/6小鼠注射毒性P.bANKA血液階段寄生蟲誘導(dǎo)的,C57BL/6小鼠于感染后8-11天死于麻痹和昏迷,蟲血癥為10-20％。相比而言,抵抗型BALB/c和DBA/2小鼠經(jīng)歷類似的寄生蟲生長(zhǎng)但不發(fā)生腦病變,于感染后3-4W死于貧血和過(guò)度蟲血癥(>60％)。從腦瘧癥狀的臨床得分來(lái)看,C57BL/6小鼠得分高于BALB/c和DBA

13、/2小鼠。
　　 2、易感和抵抗小鼠感染期間脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎性細(xì)胞因子、抗炎性細(xì)胞因子和NO水平的動(dòng)態(tài)檢測(cè)
　　 CM易感C57BL/6鼠和抵抗BALB/c與DBA/2鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17及NO于感染后開始升高,感染后5天達(dá)峰值,感染后8天下降(C57BL/6鼠呈現(xiàn)輕微下降)。三種鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清抗炎性細(xì)胞因子IL-10也于感染后5天達(dá)峰值,在感染后8天C57BL/

14、6鼠IL-10水平顯著下降,抵抗BALB/c與DBA/2鼠IL-10水平輕微下降。易感鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎性細(xì)胞因子和NO水平顯著高于抵抗鼠,而IL-10水平顯著低于抵抗鼠。
　　 3、易感和抵抗小鼠感染后不同時(shí)間點(diǎn)脾CD4+T細(xì)胞中Tregs的百分比和絕對(duì)數(shù)
　　 CM易感鼠和抵抗鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Tregs百分比和絕對(duì)數(shù)于感染后開始升高,感染后3天達(dá)峰值,感染后5天到8天逐漸下降。并且在感染期間,C57BL/6鼠

15、脾臟CD4+T細(xì)胞中Tregs百分比和絕對(duì)數(shù)顯著低于BALB/c和DBA/2小鼠。
　　 4、體內(nèi)CD25消除后Tregs效應(yīng)分析
　　 CD25消除的C57BL/6、BALB/c和DBA/2小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Tregs百分?jǐn)?shù)顯著低于相應(yīng)對(duì)照鼠。與正常感染鼠相比,Tregs消除的C57BL/6鼠幸存率明顯增加,感染后5、6、7天感染率顯著下降,CM癥狀的臨床得分也相應(yīng)減少,CD25消除的C57BL/6鼠不發(fā)生腦瘧癥

16、狀,于感染后3-4周死于貧血和過(guò)度蟲血癥。CD25消除的BALB/c和DBA/2鼠與正常感染鼠感染過(guò)程相似,但在感染初期蟲血癥得到暫時(shí)控制,CD25消除后8天Tregs快速恢復(fù),抑制T細(xì)胞活化,不能控制蟲血癥,這些鼠于感染后3-4周死于過(guò)度蟲血癥和嚴(yán)重貧血。CD25消除明顯逆轉(zhuǎn)IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及NO產(chǎn)生。CD25消除的DBA/2小鼠與CD25消除的BALB/c小鼠的感染進(jìn)程和細(xì)胞因子產(chǎn)生過(guò)程相似。

17、
　　 5、易感和抵抗鼠感染后不同時(shí)間Tregs與IFN-γ、TNF-α、NO及IL-10與蟲血癥的相關(guān)性分析
　　 腦瘧易感鼠和抵抗鼠感染期間Tregs數(shù)量與IFN-γ、TNF-α、NO產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān),IL-10產(chǎn)生與蟲體血癥水平正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1、前炎癥應(yīng)答和抗炎癥應(yīng)答之間平衡的設(shè)立對(duì)控制重型瘧疾發(fā)生至關(guān)重要,Tregs是維持此平衡的重要調(diào)節(jié)因子。
　　 2、Tregs通過(guò)修飾前炎癥