Ihh-PTHrP信號軸對前軟骨干細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 本研究旨在明確Ihh和PTHrP雙信號在大鼠來源前軟骨干細(xì)胞中的表達情況；觀察Ihh-PTHrP信號軸對細(xì)胞生命活動的影響；應(yīng)用通路阻斷和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法對Ihh和PTHrP信號的活性進行雙向調(diào)節(jié)，通過基因水平、蛋白水平及細(xì)胞生物學(xué)功能的檢測，試圖揭示Ihh-PTHrP雙信號單獨或協(xié)同作用下對前軟骨干細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響及其調(diào)控機制；同時對Ihh和PTHrP信號通路間的相互調(diào)節(jié)作用，以及通路可調(diào)控性、調(diào)控手

2、段和調(diào)控效果進行較全面的評估。為構(gòu)建具有可調(diào)控生長與分化能力軟骨組織工程種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.應(yīng)用顯微外科技術(shù)分離出生后不同周齡大鼠的股骨干骺端組織，通過HE染色觀察大鼠干骺端軟骨組織結(jié)構(gòu)，用免疫組織化學(xué)染色觀察Ihh和PTHrP雙信號在不同發(fā)育程度干骺端軟骨組織中的表達和定位情況。
　　 2.應(yīng)用顯微外科和免疫磁珠篩選技術(shù)從大鼠軟骨膜La Croix環(huán)處獲得純化的前軟骨干細(xì)胞，

3、并經(jīng)免疫組化和免疫熒光進行FGFR3和ColⅡ表型鑒定。
　　 3.應(yīng)用Hh信號通路特異性阻滯劑cyclopamine以不同濃度抑制Ihh信號，通過PTHrP真核質(zhì)粒（pEGPF-N1-PTHrP）轉(zhuǎn)染增強PTHrP信號；設(shè)立對照組、單信號干預(yù)組和雙信號干預(yù)組，研究Ihh-PTHrP雙信號對前軟骨干細(xì)胞的獨立或協(xié)同調(diào)控作用及機制。
　　 4.應(yīng)用細(xì)胞RNA提取及RT-PCR技術(shù)，檢測Hh蛋白家族以及Hh信號通路相關(guān)基

4、因（Ihh、Shh、Dhh、Ptch和Smo）在前軟骨干細(xì)胞中的表達情況；以及干預(yù)后信號通路相關(guān)基因（PTHrP、Ptch、Ihh、Smo）和增殖/凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、p21）的表達變化；通過Western Blot檢測信號蛋白（Ihh、PTHrP）的表達變化。
　　 5.應(yīng)用MTT和BrdU摻入法檢測不同實驗組細(xì)胞增殖和DNA合成情況，AnnexinV-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.應(yīng)用免疫組織

5、化學(xué)和阿爾辛藍染色法，觀察干預(yù)后前軟骨干細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達，觀察細(xì)胞的分化情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.免疫組化顯示，Ihh和PTHrP信號在大鼠干骺端發(fā)育過程中持續(xù)表達，且主要位于肥大軟骨細(xì)胞層和次級骨化中心內(nèi)。提示其活性與軟骨內(nèi)成骨過程中骨基質(zhì)的形成密切相關(guān)。
　　 2.成功獲得了性狀和表型一致的前軟骨干細(xì)胞，經(jīng)鑒定同時表達FGFR3和ColⅡ蛋白，符合前軟骨干細(xì)胞表型特點。
　　 3

6、.PCR結(jié)果顯示，Hh和PTHrP信號存在于PSCs中，且信號蛋白以Ihh亞型為主，Dhh和Shh表達微弱。阻斷Ihh信號后，觀察到前軟骨干細(xì)胞失去原有形態(tài)出現(xiàn)老化現(xiàn)象。
　　 4.經(jīng)PCR和MTT檢測，cyclopamine對于Ihh信號通路的抑制存在劑量和時間依賴關(guān)系；轉(zhuǎn)染pEGPF-N1-PTHrP質(zhì)粒后兩周，目的基因在細(xì)胞內(nèi)仍顯著表達。提示上述方式均可以有效調(diào)控Ihh和PTHrP信號的活性。
　　 5.在阻斷Ih

7、h信號的試驗中還發(fā)現(xiàn)，PTHrP的基因和蛋白表達水平隨Ihh的下降而下降；而在過表達PTHrP的試驗中卻發(fā)現(xiàn)Ihh的表達被抑制。提示Ihh可以促進PTHrP的表達，而PTHrP對Ihh可產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
　　 6.MTT和BrdU檢測發(fā)現(xiàn)，Ihh信號阻斷后前軟骨干細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，AnnexinⅤ檢測提示其凋亡率增加，而過表達PTHrP信號不能糾正這一影響。提示Ihh信號的存在可促進前軟骨干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，

8、這一調(diào)節(jié)作用不依賴PTHrP的存在。
　　 7.通過基因表達檢測發(fā)現(xiàn)，p21和Bcl-2可能參與介導(dǎo)Ihh對前軟骨干細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，但具體機制有待進一步研究。
　　 8.在細(xì)胞分化的研究中，Ihh信號抑制后和對照組比較ColⅡ的表達下降，ColⅩ表達升高，細(xì)胞外蛋白多糖的合成減少；而過表達PTHrP信號可以不依賴Ihh信號的存在發(fā)揮抑制前軟骨細(xì)胞過分化的作用。提示Ihh信號對前軟骨干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)是通過PTHrP信

9、號介導(dǎo)的，而后者可以獨立抑制前軟骨干細(xì)胞的分化。
　　 結(jié)論：
　　 通過上述研究，我們認(rèn)為Ihh和PTHrP信號通路參與大鼠長骨干骺端軟骨內(nèi)成骨過程。在軟骨膜來源的前軟骨干細(xì)胞中也存Ihh和PTHrP信號通路，兩者構(gòu)成Ihh-PTHrP信號軸，并通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制相互影響和制約，以獨立或協(xié)同的方式對細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。一方面，Ihh信號的存在可以促進前軟骨干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，這一作用不依賴PTHr