Ihh-PTHrP信號軸對前軟骨干細胞增殖、凋亡和分化的調控及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 本研究旨在明確Ihh和PTHrP雙信號在大鼠來源前軟骨干細胞中的表達情況；觀察Ihh-PTHrP信號軸對細胞生命活動的影響；應用通路阻斷和質粒轉染的方法對Ihh和PTHrP信號的活性進行雙向調節(jié)，通過基因水平、蛋白水平及細胞生物學功能的檢測，試圖揭示Ihh-PTHrP雙信號單獨或協(xié)同作用下對前軟骨干細胞增殖、凋亡和分化的影響及其調控機制；同時對Ihh和PTHrP信號通路間的相互調節(jié)作用，以及通路可調控性、調控手

2、段和調控效果進行較全面的評估。為構建具有可調控生長與分化能力軟骨組織工程種子細胞提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.應用顯微外科技術分離出生后不同周齡大鼠的股骨干骺端組織，通過HE染色觀察大鼠干骺端軟骨組織結構，用免疫組織化學染色觀察Ihh和PTHrP雙信號在不同發(fā)育程度干骺端軟骨組織中的表達和定位情況。
　　 2.應用顯微外科和免疫磁珠篩選技術從大鼠軟骨膜La Croix環(huán)處獲得純化的前軟骨干細胞，

3、并經免疫組化和免疫熒光進行FGFR3和ColⅡ表型鑒定。
　　 3.應用Hh信號通路特異性阻滯劑cyclopamine以不同濃度抑制Ihh信號，通過PTHrP真核質粒（pEGPF-N1-PTHrP）轉染增強PTHrP信號；設立對照組、單信號干預組和雙信號干預組，研究Ihh-PTHrP雙信號對前軟骨干細胞的獨立或協(xié)同調控作用及機制。
　　 4.應用細胞RNA提取及RT-PCR技術，檢測Hh蛋白家族以及Hh信號通路相關基

4、因（Ihh、Shh、Dhh、Ptch和Smo）在前軟骨干細胞中的表達情況；以及干預后信號通路相關基因（PTHrP、Ptch、Ihh、Smo）和增殖/凋亡相關基因（Bcl-2、p21）的表達變化；通過Western Blot檢測信號蛋白（Ihh、PTHrP）的表達變化。
　　 5.應用MTT和BrdU摻入法檢測不同實驗組細胞增殖和DNA合成情況，AnnexinV-PI流式細胞術檢測細胞凋亡情況。
　　 6.應用免疫組織

5、化學和阿爾辛藍染色法，觀察干預后前軟骨干細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達，觀察細胞的分化情況。
　　 研究結果：
　　 1.免疫組化顯示，Ihh和PTHrP信號在大鼠干骺端發(fā)育過程中持續(xù)表達，且主要位于肥大軟骨細胞層和次級骨化中心內。提示其活性與軟骨內成骨過程中骨基質的形成密切相關。
　　 2.成功獲得了性狀和表型一致的前軟骨干細胞，經鑒定同時表達FGFR3和ColⅡ蛋白，符合前軟骨干細胞表型特點。
　　 3

6、.PCR結果顯示，Hh和PTHrP信號存在于PSCs中，且信號蛋白以Ihh亞型為主，Dhh和Shh表達微弱。阻斷Ihh信號后，觀察到前軟骨干細胞失去原有形態(tài)出現(xiàn)老化現(xiàn)象。
　　 4.經PCR和MTT檢測，cyclopamine對于Ihh信號通路的抑制存在劑量和時間依賴關系；轉染pEGPF-N1-PTHrP質粒后兩周，目的基因在細胞內仍顯著表達。提示上述方式均可以有效調控Ihh和PTHrP信號的活性。
　　 5.在阻斷Ih

7、h信號的試驗中還發(fā)現(xiàn)，PTHrP的基因和蛋白表達水平隨Ihh的下降而下降；而在過表達PTHrP的試驗中卻發(fā)現(xiàn)Ihh的表達被抑制。提示Ihh可以促進PTHrP的表達，而PTHrP對Ihh可產生負反饋調節(jié)作用。
　　 6.MTT和BrdU檢測發(fā)現(xiàn)，Ihh信號阻斷后前軟骨干細胞的增殖活性受到明顯抑制，AnnexinⅤ檢測提示其凋亡率增加，而過表達PTHrP信號不能糾正這一影響。提示Ihh信號的存在可促進前軟骨干細胞的增殖并抑制其凋亡，

8、這一調節(jié)作用不依賴PTHrP的存在。
　　 7.通過基因表達檢測發(fā)現(xiàn)，p21和Bcl-2可能參與介導Ihh對前軟骨干細胞增殖和凋亡的調控，但具體機制有待進一步研究。
　　 8.在細胞分化的研究中，Ihh信號抑制后和對照組比較ColⅡ的表達下降，ColⅩ表達升高，細胞外蛋白多糖的合成減少；而過表達PTHrP信號可以不依賴Ihh信號的存在發(fā)揮抑制前軟骨細胞過分化的作用。提示Ihh信號對前軟骨干細胞分化的調節(jié)是通過PTHrP信

9、號介導的，而后者可以獨立抑制前軟骨干細胞的分化。
　　 結論：
　　 通過上述研究，我們認為Ihh和PTHrP信號通路參與大鼠長骨干骺端軟骨內成骨過程。在軟骨膜來源的前軟骨干細胞中也存Ihh和PTHrP信號通路，兩者構成Ihh-PTHrP信號軸，并通過負反饋調節(jié)機制相互影響和制約，以獨立或協(xié)同的方式對細胞的增殖和分化發(fā)揮關鍵性調節(jié)作用。一方面，Ihh信號的存在可以促進前軟骨干細胞的增殖并抑制其凋亡，這一作用不依賴PTHr