凝血酶對體外培養(yǎng)的家兔虹膜色素上皮細胞的增殖作用的實驗研究.pdf

1、目的：探討凝血酶對虹膜色素上皮細胞的影響。本實驗將研究凝血酶對虹膜色素上皮細胞的生長的增殖作用，為進一步由虹膜色素上皮細胞轉(zhuǎn)分化生成晶狀體提供一些實驗的依據(jù)。 方法： 1、體外培養(yǎng)家兔虹膜色素上皮細胞。 2、對培養(yǎng)的家兔虹膜色素上皮細胞進行免疫組織化學鑒定。 3、利用體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細胞，觀察不同濃度的凝血酶對虹膜色素上皮細胞的影響。將虹膜色素上皮細胞接種至96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，隨機分為5組

2、進行實驗(1-5組)，1組為對照組，2-5組為實驗組，分別加入0.1，0.5，1.0，5.0NU/ml的凝血酶，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。用MTT法測定各孔貼壁細胞數(shù)量的吸光度值。 4、根據(jù)上一實驗的結(jié)果，選定0.5NU/ml為實驗組加入凝血酶的濃度。將培養(yǎng)的細胞調(diào)整濃度，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，隨機分為兩組進行實驗，對照組加入0.5NU/ml的凝血酶，實驗組加入0.5NU/ml的凝血酶和等量的凝

3、血酶抑制劑，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。用MTT法測定各孔貼壁細胞數(shù)量的吸光度值。 5、數(shù)據(jù)分析用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果采用t檢驗，以P<0.05作為差異有顯著意義。 結(jié)果： 1、原代IPE細胞核圓，胞漿內(nèi)充滿了黑色的色素顆粒。密集處細胞大多數(shù)為多角形或者為方形，稀疏處細胞呈梭形。傳代后的細胞形態(tài)與原代相似，但隨著傳代次數(shù)的增加細胞體積有所增大，細胞胞漿中的黑色色素顆粒也越

4、來越少。細胞逐漸老化，胞漿界限模糊。 2、細胞免疫組化染色結(jié)果幾乎所有細胞的胞漿都呈現(xiàn)棕黃色，細胞核呈藍紫色。 3、不同濃度凝血酶對虹膜色素上皮細胞的作用 MTT法結(jié)果顯示，凝血酶對體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細胞有增殖作用，具有明顯的劑量依賴性，各組與對照組之間比較的差異有統(tǒng)計學意義，隨著凝血酶劑量的增加，虹膜色素上皮細胞的增殖作用也增加。 4、凝血酶及其抑制劑對虹膜色素上皮細胞的作用 MTT法結(jié)果顯示，凝血酶對體外

5、培養(yǎng)的虹膜色素上皮細胞的增殖作用能被凝血酶抑制劑所抑制，并且差異有統(tǒng)計學意義。 討論： 凝血酶為絲氨酸蛋白酶超家族成員之一，具有酶活性的凝血酶是血漿中凝血酶原經(jīng)由凝血酶原酶復合物(prothrombinase complex)(凝血因子X a與凝血因子Va結(jié)合形成1：1的復合物)催化裂解形成。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凝血酶除了參與血液凝固以及血栓形成的作用外還存在著其他的功能，例如：炎癥反應，傷口愈合，組織重建，激活生長因子，

6、胚胎發(fā)生，以及正常和異常的生長調(diào)控。大部分凝血酶在血液中的存在方式是前體形式，即凝血酶原。在傷口處引起血液成分的聚集影響愈合反應。 體外培養(yǎng)虹膜色素上皮細胞在凝血酶的作用下有明顯的增殖，而且細胞的增殖對凝血酶具有一定的劑量依賴性。隨著凝血酶的濃度的提高，虹膜色素上皮細胞的增殖作用也增強。在白內(nèi)障手術(shù)中，手術(shù)刺激使血管的通透性增強以及在手術(shù)過程中血一房水屏障的破壞或者削弱都可能使原本在血管內(nèi)的凝血酶進入眼房水中，參與促進虹膜色素上

7、皮細胞增殖生長的活動。當加入凝血酶抑制劑后，虹膜色素上皮細胞的生長即被抑制。很明顯，凝血酶對于虹膜色素上皮細胞的促進其增殖的作用可以通過凝血酶的抑制劑而抑制。但是，我們可以看出雖然凝血酶抑制劑的抑制作用有統(tǒng)計學意義，但是不能完全抑制，也就是說，凝血酶在對虹膜色素上皮細胞的促進增殖的作用中，不單單是本身的直接作用，可能還存在其衍生物或者其他作用，這些額外的作用目前還不了解，尚有待研究。凝血酶對體外培養(yǎng)的虹膜色素上皮細胞具有促進增殖的作用，