PDE4抑制劑合用CTX對T24膀胱癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖和侵襲的影響.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在國內(nèi)居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第一位，多為移行上皮來源，具有多發(fā)生和容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。目前以手術(shù)治療為主，術(shù)后采用定期膀胱腔內(nèi)灌注化療。既往化療藥物大部分是細(xì)胞毒性藥物，選擇性差，毒副作用大，對正常組織細(xì)胞損傷大。以腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)為基礎(chǔ)的分子靶向治療為腫瘤治療學(xué)開辟了新領(lǐng)域，分子靶向性藥物以腫瘤細(xì)胞的特性改變?yōu)樽饔冒悬c(diǎn)，具有有效，選擇性高和副作用小的特點(diǎn)，因此研究膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，對于發(fā)展膀胱癌新的

2、治療手段具有重要的意義。 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能的cAMP，是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其濃度的變化影響著細(xì)胞內(nèi)多種生命活動的變化，升高cAMP的藥物或cAMP類似物在多種腫瘤細(xì)胞上顯示了細(xì)胞周期阻滯，抑制增殖，促凋亡，誘導(dǎo)腫瘤分化的作用。細(xì)胞內(nèi)cAMP的降解由磷酸二酯酶（PDE）超家族控制，PDE超家族由11個(gè)家族21個(gè)亞型構(gòu)成，其分布具有組織細(xì)胞特異性，是開發(fā)靶向性藥物用于疾病治療的良好靶點(diǎn)，研究PDE亞型在膀胱癌細(xì)胞上的

3、表達(dá)以及相應(yīng)特異性抑制劑對膀胱癌細(xì)胞的影響，提高治療藥物的靶向性，可為膀胱癌的治療提供新的方向。 研究目的： 研究PDE亞型在膀胱癌細(xì)胞上的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)采用特異性PDE抑制劑篩選出在膀胱癌細(xì)胞上起主要的PDE亞型，觀察在低劑量情況下，起主要作用的PDE亞型特異性抑制劑聯(lián)合霍亂毒素（CTX）對膀胱癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)，增殖和侵襲等惡性行為的影響。 方法： 1．采用實(shí)時(shí)定量RT—PCR檢測21個(gè)PDE亞型在

4、T24膀胱癌細(xì)胞上的mRNA的表達(dá)水平，倒置相差特異性PDE抑制劑對T24細(xì)胞形態(tài)改變率的影響，選出對T24細(xì)胞形態(tài)影響最明顯的特異性PDE抑制劑。 2．倒置相差顯微鏡觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)確定PDE4抑制劑—rolipram和CTX不引起T24細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變的最大無效量。 3．倒置相差顯微鏡觀察合用最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。 4．激光共聚焦顯微鏡觀察合用最大無效量的rolipram

5、和CTX對T24細(xì)胞骨架蛋白microtubule和actin的影響；western blot檢測合用最大無效量的rolipram和CTX對微管解聚的影響。 5．MTT檢測合用最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測合用最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞周期的影響。 6．劃痕實(shí)驗(yàn)檢測合用最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞遷移能力的影響，transwe11實(shí)

6、驗(yàn)檢測合用最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞侵襲能力的影響。 7．ElISA方法檢測最大無效量的rolipram和CTX對T24細(xì)胞內(nèi)cAMP聚集的影響。 結(jié)果： 1．PDE亞型在T24細(xì)胞株上的mRNA表達(dá)水平存在差異，PDE1C，PDE4A，PDE4B，PDE5A，PDE8A，PDE9A在T24細(xì)胞上有比較豐富的表達(dá)。特異性PDE4抑制劑引起T24細(xì)胞形態(tài)改變最明顯。 2．在無血清情況下

7、，Rolipram低于30umol，CTX低于5pg/ml不引起T24細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，合用30umolRolipram和5pg/ml CTX明顯引起T24細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。 3．合用30umolRolipram和CTX5pg/ml明顯改變T24細(xì)胞microtubule和actin的排列，引起microtubule的解聚，單用Rolipram和CTX不明顯。 4．與Rolipram和CTX單用組相比，合用30umo

8、lRolipram和CTX5pg/ml在36小時(shí)后明顯抑制T24細(xì)胞的增殖，改變細(xì)胞周期進(jìn)程，降低S期細(xì)胞，增加G1細(xì)胞。 5．合用30umolRolipram和CTX5pg/ml比較顯著的降低T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力，單用Rolipram和CTX不顯著。 6．與Rolipram和CTX單用組相比，合用30umolRolipram和CTX5pg/ml明顯升高T24細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度。 結(jié)論： PDE