甘薯胚性懸浮細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及SBD2基因在甘薯淀粉粒中表達(dá)的研究.pdf

1、本研究以徐薯55-2為材料，首先建立其胚性懸浮細(xì)胞系；然后以該懸浮細(xì)胞系為受體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯懸浮細(xì)胞系遺傳轉(zhuǎn)化體系；在此基礎(chǔ)上，將具有淀粉結(jié)合功能的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBD2轉(zhuǎn)入甘薯55-2中，進(jìn)而分析了SBD2的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因甘薯淀粉的理化性質(zhì)。結(jié)果如下： 1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的徐薯55-2懸浮細(xì)胞系遺傳轉(zhuǎn)化條件的確立 將徐薯55-2莖尖接種到MS+2mg/L2，4-D固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)得到胚性愈傷，胚性愈傷在MS+2mg

2、/L2，4-D液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)80-120d后形成再生能力強(qiáng)的懸浮細(xì)胞系。利用建立的懸浮細(xì)胞系為材料，對(duì)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。該菌株所攜帶的pTCK303質(zhì)粒上含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)農(nóng)桿菌侵染后GUS基因表達(dá)百分率得到如下結(jié)果：將達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的根癌農(nóng)桿菌菌液稀釋至為OD600nm=0.6-1.0，侵染繼代培養(yǎng)3-4d后的胚性懸浮細(xì)胞8-12min，之后共培養(yǎng)3-4d達(dá)到最高的表達(dá)

3、效率。其中采用0.45mol/L甘露醇作為滲透壓處理懸浮細(xì)胞40-80min及在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加200μmol/L乙酰丁香酮均能提高轉(zhuǎn)化效率。 2、抗生素選擇壓力的確定 由于不同甘薯品種懸浮細(xì)胞對(duì)抗生素的敏感程度不同，我們首先研究不同濃度卡那霉素對(duì)徐薯55-2胚性愈傷的存活及增殖的影響，結(jié)果表明：適宜的卡那霉素濃度為10mg/L。頭孢霉素、羧芐青霉素及萬(wàn)古霉素是遺傳轉(zhuǎn)化中常用的去除農(nóng)桿菌的抗菌素，我們比較三種抗生素對(duì)徐

4、薯55-2胚性愈傷增殖和體細(xì)胞胚的分化的影響，研究表明：最合適的抗生素為頭孢霉素，其對(duì)徐薯55-2的增殖和體細(xì)胞胚的分化影響比較小，并且其抑制農(nóng)桿菌的效果比較好，適宜的濃度為200mg/L。 3、遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生 利用上述建立的轉(zhuǎn)化體系，研究了淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD2)基因的遺傳轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌EHA105攜帶質(zhì)粒pBIN19，該質(zhì)粒攜帶SBD2和NPTII基因。將根癌農(nóng)桿菌EHA105侵染后的胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有2

5、.0 mg/L2，4-D、10 mg/L Kan和200mg/L Cefo的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4-8周的選擇培養(yǎng)，獲得抗Kan的愈傷組織。將得到的Kan抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加200 mg/L Cefo、10 mg/L Kan、1.0 mg/L ABA和1.0 mg/LGA3的MS固體培養(yǎng)基上，Kan抗性愈傷組織分化，共產(chǎn)生35個(gè)抗性芽，將這些芽轉(zhuǎn)移到含10 mg/L Kan的MS基本培養(yǎng)基上，獲得了12株再生植株.PCR

6、和Southern檢測(cè)結(jié)果表明，12株再生植株是轉(zhuǎn)基因植株，斑點(diǎn)雜交證實(shí)SBD2在轉(zhuǎn)基因甘薯淀粉中得到表達(dá)，在不同轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量有差異. 4、轉(zhuǎn)基因甘薯淀粉理化特性分析 通過(guò)光學(xué)顯微鏡(LM)和電鏡(SEM)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株以及對(duì)照植株塊根中的淀粉粒進(jìn)行理化性質(zhì)的比較分析。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因淀粉顆粒形態(tài)與對(duì)照有差異，在轉(zhuǎn)基因淀粉粒中出現(xiàn)許多小淀粉顆粒聚集、成簇存在的，而在對(duì)照淀粉中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種情況。但是，在淀粉顆粒大小透光