男性不育相關(guān)基因在精液中的篩查及分析.pdf

1、目的：
　　 全世界約有10-15%的夫妻受到不育癥的困擾,男性因素約占50%。越來越多的證據(jù)表明,不育癥的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)。所以,對男性不育相關(guān)基因進行篩查,并對其引發(fā)不育癥的機制進行探索是十分必要的。目前,在基因表達水平對男性不育癥進行分析,通常需要獲得患者的睪丸組織。睪丸活檢是一種有創(chuàng)手術(shù),應(yīng)用于對無精患者的診斷與治療中(檢測睪丸內(nèi)是否存在精子,行取精術(shù)利用輔助生殖技術(shù)孕育后代),正常人及大多數(shù)男性不育患者的睪丸組織不易

2、獲得。不育患者精液中精子過少或沒有精子,以及精子內(nèi)的基因表達不能代表全睪丸內(nèi)的基因表達情況是精液遺傳學(xué)檢測被忽視的原因。我們推測,精液中除含有精子外,還存在著其它類型睪丸細胞及這些細胞的基因表達信息。在沒有睪丸組織的情況下,以精液為樣本進行相關(guān)基因的檢測也可以對睪丸內(nèi)的基因表達情況有一個較為全面的了解。本研究旨在利用無創(chuàng)取材樣本對男性不育相關(guān)基因進行篩查,對不育癥發(fā)生機制進行探索,同時亦為無精癥患者的無創(chuàng)診斷提供依據(jù)。
　　 方

3、法：
　　 在前期研究工作獲得的“339個小鼠睪丸特異表達基因”基礎(chǔ)上,選擇在人體中表達特異性強且豐度高的各類型睪丸細胞標志基因作為候選基因,共80個。提取2例正常男性睪丸RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA,分別稀釋為1/10、1/100和1/1000倍后,檢測各候選基因的表達。2例正常男性任-1/1000倍cDNA組檢測結(jié)果為陽性,即可認為該候選基因檢驗敏感性良好,選擇這些基因進行下一步檢測。分別提取正常人精液沉淀和上清兩部分RNA,反轉(zhuǎn)

4、為cDNA后,PCR方法檢測上一步獲得的檢驗敏感性好的基因的表達,篩選出沉淀和上清中表達頻率均大于50%的高頻基因。分別提取弱精患者、無精患者精液沉淀和上清RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測弱精患者、無精患者精液沉淀和上清中高頻基因的表達。利用SPSS17.0軟件分析高頻基因在正常人、弱精患者和無精患者精液中的表達是否存在差異,并比較高頻基因在所有精液樣本沉淀、上清、全精液(沉淀+上清)中的檢測結(jié)果,同時,對高頻基因在精液沉淀和上清中的檢測

5、結(jié)果的一致性程度進行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、Kitlg、Akap4在弱精患者精液中表達頻率下調(diào),Akap4,Tnp1、Spata3,Prm1、Prm2在無精患者精液中表達頻率下調(diào)。
　　 2、部分精液樣本上清檢測結(jié)果對沉淀檢測結(jié)果有“補償”作用,高頻基因在全精液中檢測的檢出率明顯高于僅在精液沉淀或上清中檢測。
　　 3、Pou5f1等8個高頻基因在精液沉淀和上清中檢驗一致性較高,Sbf1基因在正常