疏水改性多糖及其葉酸偶合體作為納米藥物載體的研究.pdf

1、本研究對生物相容性良好的天然多糖進行了疏水改性，以通過自組裝的方法制備納米粒；再將疏水改性多糖與葉酸偶聯(lián)制備對腫瘤細胞具有靶向作用的載體材料，為腫瘤靶向制劑載體的開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.乙酰普魯蘭及其葉酸偶聯(lián)體作為納米藥物載體的研究通過乙酰化反應合成了疏水性的乙酰普魯蘭(PA)，然后以N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)為偶聯(lián)劑，4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，將葉酸與PA偶聯(lián)(FPA)；

2、采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)、氫核磁光譜(1H NMR)和X射線晶體衍射(XRD)等方法對產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)表征；溶解性研究表明PA及FPA不溶于水，但可溶于多種有機溶劑。采用溶劑擴散法制備了PA及FPA納米粒，并考察了各種制備條件對納米粒形成的影響以確定最佳制備方法，結(jié)果表明，納米粒粒徑受到乙?；〈?、材料濃度、水相中PVA濃度、有機相/水相比值以及有機溶劑的種類等因素影響。以表阿霉素(epirubicin，EPI)為模型藥物考察了

3、乙?；〈取⑺幬?材料比值及脫鹽酸時三乙胺/表阿霉素摩爾比對納米粒載藥的影響；動態(tài)光散射粒徑分析顯示載藥納米粒粒徑隨載藥量增加而增大，透射電鏡觀察納米粒載藥前后均為球形。采用透析法測定納米粒中表阿霉素的體外釋放，藥物釋放速度依次為：FPA>PAl>PA2>PA3；不同pH釋放介質(zhì)藥物釋放速度依次為：pH6.4>pH7.0>pH7.4。 采用激光共聚焦顯微鏡觀察游離EPI、PA/EPI納米粒和FPA/EPI納米粒溫育不同時間KB

4、細胞攝取的情況，結(jié)果表明，三種表阿霉素制劑在細胞內(nèi)的分布有一個動態(tài)變化過程，以游離表阿霉素最容易進入細胞核，其次為FPA/EPI納米粒，最后為PA/EPI納米粒。流式細胞分析儀檢測結(jié)果表明，各種表阿霉素制劑進入細胞量在4h內(nèi)隨溫育時間的延長而增加，溫育1h細胞內(nèi)熒光強度依次為：游離EPI>PA/EPI NPs>FPA/EPI NPs>FPA/EPI NPs+FA；溫育4h細胞內(nèi)熒光強度依次為：FPA/EPI NPs≥EPI>PA/EPI

5、 NPs>FPA/EPI NPs+FA：游離葉酸可明顯減少FPA納米粒進入細胞量，提示FPA納米粒通過葉酸受體途徑進入細胞。用MTT法測定了空白PA及FPA納米粒對KB及L929細胞的毒性，結(jié)果表明兩種空白納米粒均無明顯的毒性；游離表阿霉素、PA/EPI及FPA/EPI納米粒對KB細胞的毒性隨溫育時間的延長而增加，F(xiàn)PA納米粒表現(xiàn)得尤其明顯；FPA/EPI納米粒在KB細胞的毒性可被過量游離葉酸抑制，提示FPA納米粒與游離葉酸競爭細胞膜表

6、面葉酸受體。對L929細胞的毒性實驗結(jié)果表明，在相同的濃度下納米粒包載表阿霉素的毒性弱于游離表阿霉素。 2.脫氧膽酸修飾殼聚糖及其葉酸偶聯(lián)體作為納米藥物載體的研究脫氧膽酸及葉酸結(jié)構(gòu)中的羧基通過與殼聚糖結(jié)構(gòu)中的氨基偶聯(lián)，生成脫氧膽酸修飾殼聚糖(CS-DA)及其葉酸偶聯(lián)體(FA-CS-DA)。采用FT-IR、1H NMR、XRD等方法對該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了表征，結(jié)果表明葉酸通過化學鍵偶聯(lián)于CS-DA。CS-DA1～3中脫氧膽酸的取代度用

7、元素分析法進行測定分別為9.6、7.7及2.8；FA-CS-DA1，2中葉酸的取代度用紫外法分析分別為170μmol/g聚合物及186μmol/g聚合物。采用透析-超聲法制備了CS-DA及FA-CS-DA自組裝納米粒，熒光探針法研究其自組裝行為，結(jié)果顯示，CS-DA的臨界膠束濃度(CMC)因脫氧膽酸取代度不同而在0.015mg/ml～0.046mg/ml內(nèi)變化，F(xiàn)A-CS-DA1和FA-CS-DA2的CMC分別為0.028mg/ml和0

8、.049mg/ml；CS-DA納米粒粒徑為115.7nm～196.5nm，F(xiàn)A-CS-DA粒徑為200nm～350nm。用超聲法將全反式維甲酸(ATRA)包裹于CS-DA和FA-CS-DA納米粒中，其包載率達12％，粒徑隨ATRA載藥量增加而增加。 用熒光素異硫氰酸酯標記的納米粒進行了納米粒的體外攝取研究(KB細胞)，并采用熒光分光光度法測定了納米粒的攝取量，結(jié)果顯示，在0.5～2h內(nèi)納米粒攝取量隨溫育時間增加而增加，細胞對相同

9、濃度FA-CS-DA納米粒攝取量高于CS-DA納米粒，且KB細胞對FA-CS-DA納米粒的攝取可被過量游離葉酸所抑制，提示葉酸受體參與了FA-CS-DA與KB細胞的結(jié)合和/或攝取。 總之，疏水改性多糖及其葉酸偶聯(lián)體可通過自組裝的方法制備納米粒，制備方法簡單可行，該納米?？勺鳛樗幬镙d體包載雙親性或疏水性藥物，從而延緩藥物的釋放和增加藥物的穩(wěn)定性。葉酸偶聯(lián)多糖納米粒在葉酸高表達KB細胞主要通過葉酸受體途徑進入細胞，對腫瘤細胞表現(xiàn)一定