UPR聯(lián)合SREBP-1c在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致大鼠NASH形成中的作用及意義.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是近年來逐漸認(rèn)識(shí)到的十分常見的慢性肝病，包括單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和NASH相關(guān)性肝纖維化及肝硬化。NASH具有脂肪變性、肝細(xì)胞損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，可發(fā)展演化為肝硬化、肝癌，一般預(yù)后較差。NASH的

2、發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，目前普遍接受的是以胰島素抵抗(insulinresistance，IR)、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”學(xué)說。 肝細(xì)胞內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及儲(chǔ)存鈣的主要場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)各種刺激極為敏感，當(dāng)機(jī)體功能紊亂時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS主要激活三條信號(hào)通路：未

3、折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)、超負(fù)荷反應(yīng)(endoplasmic reticulum overload response，EOR)和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。近年來對(duì)于ERS信號(hào)通路及其效應(yīng)在代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)如肥胖、IR和2型糖尿病等中的研究十分廣泛。因此，我們認(rèn)為作為與MS密切相關(guān)的NASH，其發(fā)病機(jī)制可能與ERS信號(hào)通路存在重要的聯(lián)系。 既往研究發(fā)

4、現(xiàn)脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生一定量的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，而ROS又是ERS的重要誘發(fā)因素，因此我們推測(cè)當(dāng)高脂飲食引起脂肪酸過載時(shí)，通過產(chǎn)生ROS和脂質(zhì)過氧化物觸發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生ERS，啟動(dòng)UPR和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)途徑，其中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-lc(sterol regulatory element bindingprotein，SREBP-1c)表達(dá)上調(diào)，可增加脂肪合成酶等的表達(dá)，造成脂肪酸合

5、成異常增多，肝臟脂質(zhì)代謝障礙；當(dāng)出現(xiàn)過強(qiáng)或者持久刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂得不到修正，造成UPR過載，激發(fā)氧化應(yīng)激，引起脂肪變的肝細(xì)胞發(fā)生變性和壞死，從而導(dǎo)致NASH的發(fā)生。本研究旨在通過檢測(cè)ERS時(shí)UPR和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志性分子在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NASH形成中的表達(dá)變化，初步探討ERS在NASH形成中的作用及意義。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 研究?jī)?nèi)容和方法： Wistar成年雄性大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)與

6、NASH組。其中NASH組分為4、8、12、16周4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，各時(shí)相點(diǎn)隨機(jī)分配6只動(dòng)物。C組給予基礎(chǔ)飼料，NASH組給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料82.5％，豬油10％，膽固醇2％，蔗糖5％，膽鹽0.5％)。動(dòng)態(tài)觀察各組：①HE染色光鏡觀察肝臟組織病理改變；②血清FFA、TG、ALT、AST含量的測(cè)定；③肝組織MDA、FFA、ROS含量的測(cè)定；④半定量RT-PCR檢測(cè)ERS標(biāo)志物GRP78、UPR標(biāo)志物ATF6和固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)標(biāo)志物SREBP

7、-lc mRNA的表達(dá)變化；⑤相對(duì)定量PCR檢測(cè)GRP78、ATF6 mRNA的表達(dá)變化；⑥Western blot法檢測(cè)GRP78、ATF6、Phospho-PERK、SREBP-lc的蛋白表達(dá)變化。 研究結(jié)果： 1、HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變 結(jié)果顯示C組大鼠肝臟大體形態(tài)和病理切片均正常。高脂喂養(yǎng)4、8、12、16周后，肉眼可見大鼠肝臟色澤變黃，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面黃色、油膩，組織松脆；隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間的

8、延長(zhǎng)，病理學(xué)可見肝細(xì)胞脂肪變及氣球樣變，小葉中央?yún)^(qū)炎癥，腺泡3帶出現(xiàn)點(diǎn)灶狀壞死，并逐漸發(fā)展至門管區(qū)輕～中度炎癥。按非酒精性脂肪性肝病診療指南劃分為：NASH-FIGO期、F2Gl期、F3G2期、F4G3期。 2、血清FFA、TG、ALT、AST的含量變化 高脂喂養(yǎng)4周后，GO組血清FFA、TG、AST含量逐漸升高，隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，G1和G2組血清中FFA、TG、ALT、AST含量明顯增高，在16周G3組時(shí)達(dá)到高峰

9、，與C組相比相差非常顯著(P<0.01)。 3、肝組織MDA、FFA、ROS的含量變化 高脂喂養(yǎng)NASH各組大鼠肝組織MDA含量與C組相比顯著升高(P<0.01)。肝組織FFA、ROS含量由高脂喂養(yǎng)4周時(shí)開始逐步升高，16周上升最為明顯(P<0.01） 4、半定量RT-PCR檢測(cè)GRP78、ATF6和SREBP-1c mRNA表達(dá)變化 高脂喂養(yǎng)4周后，GRP78和SREBP-lc mRNA水平隨肝細(xì)胞脂肪

10、變和炎癥程度的加重而升高，在G3組中達(dá)到高峰(P<0.01)。ATF6 mRNA水平在GO組與C組相比無明顯差異(P>0.05)，在G1、G2、G3組時(shí)與C組相比明顯升高(P<0.01)。 5、相對(duì)定量PCR檢測(cè)GRP78、ATF6 mRNA的表達(dá)變化 將C組樣本設(shè)為對(duì)照，得出NASH各組樣本中目的基因GRP78和ATF6相對(duì)對(duì)照樣本的含量比值。結(jié)果顯示NASH各組GRP78和ATF6 mRNA的表達(dá)水平與C組相比升高(

11、P<0.05)，與半定量RT-PCR結(jié)果趨勢(shì)一致。 6、Westem blot法檢測(cè)GRP78、ATF6、Phospho-PERK和SREBP-1c蛋白表達(dá)變化 高脂喂養(yǎng)4周后，GRP78、ATF6和SREBP-1c蛋白表達(dá)開始增強(qiáng)，并隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，在G3組時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)。Phospho-PERK蛋白水平在喂養(yǎng)4周時(shí)與C組相比無顯著差異(P>0.05)，在G3組時(shí)達(dá)高峰(P<0.01)。

12、 結(jié)論： 1、高脂飲食誘導(dǎo)FFA生成增加，在FFA氧化過程中產(chǎn)生大量ROS、MDA，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在肝臟內(nèi)過度累積，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的因素增加： 2、在大鼠NASH形成過程中，ERS標(biāo)志物GRP78和UPR標(biāo)志物ATF6、Phospho-PERK以及固醇調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)標(biāo)志物SREBP-1c表達(dá)水平有隨著肝臟炎癥程度不斷加重而升高的趨勢(shì)： 3、高脂飲食引起ROS等應(yīng)激因素增加，通過啟動(dòng)UPR聯(lián)合SREBP-1c造成