基因芯片檢測(cè)HBV全基因組轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株早期基因的表達(dá).pdf

1、研究背景:
　　 由乙型肝炎病毒(HBV)導(dǎo)致的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病，可引起肝硬化、肝癌、終末期肝病等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前全世界HBV感染者超過(guò)3.5億人，我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)，現(xiàn)癥的CHB患者為2000-3000萬(wàn)人。干擾素和核苷類(lèi)似物用于乙肝治療取得了一定效果，但存在諸多不足之處，如價(jià)格昂貴，療效并不理想，需要長(zhǎng)期用藥，藥物耐藥逐年增長(zhǎng)。而新藥的開(kāi)發(fā)受制于基礎(chǔ)研究方面的不足，目前對(duì)病毒的生物學(xué)過(guò)程和宿主的病理學(xué)效

2、應(yīng)仍存在許多未知之處。
　　 對(duì)病毒感染和宿主反應(yīng)的研究應(yīng)從最基礎(chǔ)的水平起步。從HBV侵入人體開(kāi)始，機(jī)體的整個(gè)組織細(xì)胞-免疫網(wǎng)絡(luò)-效應(yīng)分子-免疫效應(yīng)細(xì)胞等多個(gè)成分進(jìn)入了一個(gè)整體信號(hào)協(xié)同的過(guò)程，涉及到的分子生物學(xué)機(jī)理十分復(fù)雜。在諸多的研究方法和工具中，采用高通量的基因芯片技術(shù)來(lái)探索病毒和宿主細(xì)胞之間龐大的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義。目前有關(guān)HBV感染的基因芯片研究主要包括HBV的不同蛋白成分對(duì)宿主細(xì)胞的影響、藥物治療及HBV感染的并發(fā)

3、癥方面，大多數(shù)研究結(jié)果存在分歧。由于HBV本身的異質(zhì)性、感染宿主的差異性和病理機(jī)制的復(fù)雜性，尤其是HBV作為一個(gè)整體侵入宿主細(xì)胞，不僅病毒自身各部分互相影響協(xié)調(diào)，宿主細(xì)胞更是多個(gè)復(fù)雜信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)的整體，因此上述研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前有關(guān)HBV全基因組影響細(xì)胞基因表達(dá)的生物芯片研究甚少。我們采用Affy Human U1332.0A表達(dá)譜芯片研究HBV全基因組轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株，該芯片包含了真核細(xì)胞的50000個(gè)基因，是完成本課題的有

4、力保障。
　　 研究目的:
　　 1觀察HBV全基因組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株2952的基因表達(dá)譜變化，研究HBV急性期感染對(duì)宿主細(xì)胞的影響，探索HBV感染的發(fā)病機(jī)制。
　　 2進(jìn)一步研究目前HBV感染的先天免疫發(fā)病機(jī)制中的兩大熱點(diǎn)-Toll樣受體信號(hào)途徑及NK細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)途徑，包括部分信號(hào)分子在多個(gè)細(xì)胞株的表達(dá)，探討與HBV感染的關(guān)系。
　　 材料:
　　 采用本室構(gòu)建的HBV全基因組質(zhì)粒：p

5、BlueScript-2952經(jīng)搖菌抽提質(zhì)粒后，Lgu I酶切回收3.2kbHBV DNA片斷，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，分別檢測(cè)細(xì)胞HBV RNA的表達(dá)，培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HBeAg、HBsAg的分泌。Trizol收集細(xì)胞并抽提總RNA行基因芯片檢測(cè)，對(duì)結(jié)果行生物信息學(xué)分析，包括上調(diào)和下調(diào)基因分類(lèi)，基因功能分類(lèi)，信號(hào)通路分析等等。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)驗(yàn)證部分基因在多個(gè)細(xì)胞株的表達(dá)。
　　 方法:
　　 1制備

6、HBV全基因組質(zhì)粒：引物設(shè)計(jì)，HBV全基因組擴(kuò)增的PCR程序，PCR產(chǎn)物的純化，PCR產(chǎn)物的克隆，連接SK-載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及陽(yáng)性克隆的篩選等方法見(jiàn)本課題既往研究。抽提質(zhì)粒后酶切回收純化HBV DNA。
　　 2 HBV全基因組的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞備用。
　　 3免疫組化及IMX法檢測(cè)HBV抗原表達(dá)，原位雜交及實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)HBV

7、mRNA表達(dá)。
　　 4基因芯片檢測(cè)：提取和純化細(xì)胞總RNA，分別合成和純化cDNA、cRNA，cRNA片段化，配制雜交液芯片雜交，洗脫芯片，掃描芯片及數(shù)據(jù)分析。
　　 5實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因：設(shè)計(jì)引物，轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行兩步法定量PCR。研究抑癌基因Lumican、NK細(xì)胞的激活性受體KLC、抑制性受體KIR在HBV急性感染2952細(xì)胞株，HBV陰性的HepG2、7402、MHCC97-H細(xì)胞株，H

8、BeAg陽(yáng)性的HepG2.2.15細(xì)胞株，HBsAg陽(yáng)性的Alexander細(xì)胞株的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1成功轉(zhuǎn)染HBV全基因組，免疫組化和IMX檢測(cè)到HBV抗原分泌，細(xì)胞表達(dá)HBV RNA，表明HBV全基因組轉(zhuǎn)染成功并在細(xì)胞復(fù)制翻譯。
　　 2基因芯片結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株2952與空白轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞株比較，表現(xiàn)為143個(gè)基因(0.286％)的顯著性改變，包括77個(gè)基因顯示上調(diào)，66個(gè)基因下調(diào)，以

9、早期的炎癥因子和趨化因子表達(dá)上調(diào)最明顯，癌基因和抑癌基因的表達(dá)在早期不占主要。Toll受體信號(hào)途徑中的TLR4、IL-6、IL-8及干擾素誘導(dǎo)因子等表達(dá)上調(diào)；NK細(xì)胞激活性受體KLC和抑制性受體KIR均有激活，但KLC配體維甲酸受體應(yīng)答元件1基因表達(dá)下調(diào)。本課題既往已對(duì)TLR4信號(hào)途徑作了部分研究，故進(jìn)一步研究選擇了NK細(xì)胞殺傷信號(hào)途徑中的兩個(gè)受體和參與病理性纖維化的抑癌基因Lumican。
　　 32952細(xì)胞株表達(dá)的抑制性受

10、體(KIR)為KIR3DL3，激活后使磷酸酶SHP和結(jié)合蛋白Vav等去磷酸化，該受體在e抗原陽(yáng)性的急慢性HBV感染HepG2細(xì)胞株較e抗原陰性的慢性HBV感染Alexander細(xì)胞株明顯上調(diào)；激活性受體為KLRC2(Killer cell lectin-like receptor subfamily C，member2,又名NKG2C)，在表面抗原陽(yáng)性的急性HBV感染2952細(xì)胞株和慢性HBV感染Alexander細(xì)胞株均表達(dá)上調(diào)。

11、r>　　 4抑癌基因Lumican在2952細(xì)胞株表達(dá)上調(diào)，但在慢性HBV感染的HepG2.2.15、Alexander細(xì)胞株則表達(dá)下調(diào)。
　　 5 Lumican、KIR、KLC三個(gè)基因在高侵襲性的MHCC97-H細(xì)胞株均無(wú)明顯表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1在HBV感染宿主細(xì)胞的急性期階段，主要表現(xiàn)為細(xì)胞抗感染反應(yīng)的激活，以炎癥因子、干擾素、趨化因子等的表達(dá)為主。先天免疫中的TLR家族信號(hào)途徑和NK細(xì)胞介導(dǎo)的

12、殺傷信號(hào)途徑顯著改變。
　　 2 KLC、KIR和抑癌基因在HBV急慢性感染及HBV陰性細(xì)胞株的不同表達(dá)體現(xiàn)了HBV的免疫逃避機(jī)制和致癌機(jī)理。HBeAg可能通過(guò)上調(diào)抑制性受體避免NK細(xì)胞樣的殺傷。
　　 3肝癌細(xì)胞株不僅表達(dá)NK細(xì)胞激活性受體的配體，也表達(dá)免疫細(xì)胞本身的受體，并受到HBV感染的影響，該基因是否在蛋白水平和體內(nèi)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)及表達(dá)的意義如何值得進(jìn)一步研究。
　　 4 Lumican作為抑癌基因不