鴉膽子素D對黃瓜綠斑駁花葉病毒病的抑制作用.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosic virus，CGMMV)在世界范圍內(nèi)均有分布，主要侵染葫蘆科作物，是葫蘆科作物的首要病毒病害，給人們帶來巨大的經(jīng)濟損失。CGMMV危害嚴(yán)重，防治困難，至今還沒有有效的防治手段。鴉膽子素D(Bruceine D)是從中藥鴉膽子(Brucea javanica(L.)Merr)種子中提取得到的，已有研究表明，鴉膽子素D對TMV、CMV、PVY均有很好的抑制作用，本實

2、驗對鴉膽子素D抗CGMMV進行活性研究。
　　 本實驗利用感染CGMMV的黃瓜葉片提取出病毒粒子，成功制備了CGMMV的抗血清，間接ELISA檢測其效價為1：16,000。利用感染CGMMV的黃瓜葉片提取總RNA，通過RT-PCR得到CGMMV-MP，并成功克隆到pMD18-T載體上，借助原核表達載體pET-29a構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-29a-MP，DNA序列分析表明，所得MP基因全長為795 bp，與已報告的CGMMV-G

3、X-MP基因的同源性為100[％]。IPTG誘導(dǎo)6 h后表達量最大，用超聲波破碎后檢測到融合蛋白以不可溶形式存在。SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，表達產(chǎn)物與目的蛋白大小一致，割膠免疫注射家兔得到抗體，間接ELISA檢測其效價為1：8,000，western-blot證明抗體特異性良好。
　　 在鴉膽子素D抗病毒活性研究中，分別采用半葉法、葉碟法檢測了鴉膽子素D對CGMMV侵染和增殖的影響，結(jié)果顯示，其在10 μg/mL的處理濃

4、度下，鴉膽子素D對侵染和增殖的抑制率分別為78.99[％]和81.05[％]，另外，在20 μg/mL、40 μg/mL的濃度下抑制率雖能達到90[％]，但對寄主植物產(chǎn)生明顯的藥害，枯斑寄主莧色藜和自然寄主黃瓜的葉片出現(xiàn)了大面積的干枯。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鴉膽子素D在體外能夠使病毒粒子斷裂，采用相對定量PCR試驗證明鴉膽子素D能夠有效抑制病毒的復(fù)制酶基因、運動蛋白基因、外殼蛋白基因的表達，在10 μg/mL的處理濃度下對復(fù)制酶基因、運動蛋白