玉米矮花葉病毒基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、玉米(Zea mays L.)是世界第三大作物，是重要的糧食作物和飼料作物，也是現(xiàn)代食品、醫(yī)藥和化學(xué)工業(yè)的重要原料。然而，生產(chǎn)上玉米病害一直是影響玉米產(chǎn)量的重要限制因素，傳統(tǒng)的常規(guī)育種由于抗源的缺乏和不同物種間的遺傳隔離，使抗病育種工作受到了極大的限制。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行玉米遺傳改良，增強(qiáng)玉米抗病蟲和耐逆境能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)，是玉米遺傳育種的一個(gè)新方向。近年來，玉米轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑的研究較多，但轉(zhuǎn)基因抗玉米矮花葉病毒(mai

2、ze dwarf mosaic virus，MDMV)病的報(bào)道較少。玉米矮花葉病是一種世界性病害，在世界范圍內(nèi)發(fā)生。目前確定引起我國MDMV病的病原主要有MDMV-B株系(SCMV)、高粱花葉病毒(SrMV)和白草花葉病毒(PenMV)。植物抗病毒基因工程策略有多種，前人研究表明利用RNAi原理介導(dǎo)的抗病性特異性強(qiáng)，較易獲得高抗甚至免疫的轉(zhuǎn)基因植株，為作物抗病毒基因工程提供了更有效的途徑。本研究對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化PenMV、SCMV

3、基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期獲得抗玉米矮花葉病毒的轉(zhuǎn)基因玉米。 為建立玉米自交系的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，探討RNAi技術(shù)在抗玉米矮花葉病毒基因工程中的應(yīng)用效果，本研究以生產(chǎn)上常用的玉米自交系E28、旅9、478、黃早4、9801、豫12、齊319、黃C等22份為試驗(yàn)材料，通過幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生植株分化比較，研究影響胚性愈傷組織形成及植株分化的因素(基因型、培養(yǎng)基激素組成、幼胚大小、接種方式、繼代次數(shù)等)；利用SSR技術(shù)研究玉

4、米幼胚培養(yǎng)能力與遺傳基礎(chǔ)的關(guān)系，建立幼胚培養(yǎng)特性的評價(jià)體系。根據(jù)RNAi原理構(gòu)建了玉米矮花葉病毒基因(PenMV HC-Pro和SCMV CI)反向重復(fù)序列表達(dá)載體，以E28、旅9、齊319等的胚性愈傷組織為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將PenMV HC-Pro基因和SCMV CI基因的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)入玉米自交系，系統(tǒng)研究了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素(農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)溫度、負(fù)壓處理、超聲波處理、繼代次數(shù)等)。獲得的主要結(jié)

5、果如下： 1．構(gòu)建了玉米矮花葉病毒基因(PenMV HC和SCMV CI)反向重復(fù)序列表達(dá)載體。 對PenMV-B的HC基因與PenMV-C的HC基因進(jìn)行同源性分析，確定HC基因的保守片段；對SCMV-BJ的CI基因與SCMV-ZJ、SCMV-SX、SCMV-SD的CI基因同源性比較，確定CI基因的保守片段。分別根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，以PenMV HC-Pro基因和SCMV CI基因的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增能形成“發(fā)

6、夾結(jié)構(gòu)”的正反向片段，連接后插入到質(zhì)粒載體pCAMBIA3301。通過凍融法將載體直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化。 2．建立了玉米自交系受體系統(tǒng)。 以E28、旅9、齊319、黃早4、478、昌7-2、黃C、7922等22份自交系為試材，以胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和再生植株分化率為評價(jià)指標(biāo)，對幼胚大小、接種方式、基因型、培養(yǎng)基激素組成、繼代次數(shù)、AgNO<,3>濃度等影響因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明基因型、幼胚大小、繼代次數(shù)、Ag

7、NO<,3>濃度等是玉米幼胚培養(yǎng)胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的重要影響因素。在N<,6>培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加3mg/L 2,4-D、0.2mg/L IAA和8～12mg/L AgNO<,3>利于誘導(dǎo)胚性愈傷組織；添加lmg/L KT和0.5mg/L IBA利于誘導(dǎo)再生植株分化和生根；一般愈傷組織繼代5～7次可以調(diào)整到較佳狀態(tài)，其胚性率和植株分化率都較高。篩選再生植株分化率較高的基因型有E28、旅9、齊319、黃早4、502，胚性愈傷組織誘

8、導(dǎo)率最高達(dá)83.5％，分化率可達(dá)80％。 3．建立了預(yù)測評價(jià)玉米自交系幼胚培養(yǎng)特性的分子評價(jià)體系。 利用22份玉米自交系對30對多態(tài)性較好SSR引物進(jìn)一步篩選，獲得14對多態(tài)性引物(mmc0022，bnlg1671，phi308707，phi96100，umc1165，bnlg1018，phi090，phi37418，umc1122，mmc0071，umc1359，phi080，bnlg1538，phi015)對22份材

9、料進(jìn)行遺傳關(guān)系聚類。結(jié)果表明遺傳聚類結(jié)果與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、再生植株分化率聚類結(jié)果的吻合度平均達(dá)88％，表明遺傳基礎(chǔ)關(guān)系較近的材料，其幼胚培養(yǎng)能力也有相似性，利用選出的14對SSR引物可以較可靠評價(jià)選擇玉米自交系的幼胚培養(yǎng)能力．這為快速評價(jià)玉米自交系幼胚培養(yǎng)能力提供了分子依據(jù)。 4．建立了玉米自交系胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 以E28、旅9、齊319等的胚性愈傷組織為受體，轉(zhuǎn)化表達(dá)載體p3301HCIR，研究了農(nóng)桿菌

10、菌株(LBA4404和EHA105)、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、負(fù)壓處理、超聲波處理、乙酰丁香酮(AS)、篩選方式等因素對玉米轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明：菌株LBA4404，共培養(yǎng)培養(yǎng)基和感染液中加入100μg/L的AS，菌液濃度OD<,600>=0.5～0.7，侵染時(shí)間20～25min(輔助負(fù)壓處理10min)，25℃共培養(yǎng)3d，PPT為5、10、5mg/L進(jìn)行三次篩選獲得抗性愈傷組織頻率最高，達(dá)20.2％。菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)

11、時(shí)間3個(gè)因素之間相互作用，共同影響轉(zhuǎn)化效果，其中重要的因素是菌液濃度和侵染時(shí)間。獲得18株P(guān)CR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，E28轉(zhuǎn)化獲得5株、齊319轉(zhuǎn)化獲得11株、旅9獲得2株。3種基因型中，齊319對農(nóng)桿菌侵染力較強(qiáng)，獲得的抗性愈傷組織頻率和轉(zhuǎn)化苗最多，適合作為今后玉米遺傳轉(zhuǎn)化良好的受體。初步建立了較為優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。 5．轉(zhuǎn)PenMV HC-Pro反向重復(fù)片段玉米的檢測與遺傳分析。 18株P(guān)CR

12、檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，對其中生長健壯的9株進(jìn)行Southern雜交檢測分析，8株呈陽性(6株單拷貝，2株雙拷貝)，證明單拷貝形式整合到玉米基因組不同位點(diǎn)的頻率為66.7％。其中4株(齊319有2株，E28有2株)正常可育，形成轉(zhuǎn)基因株系。經(jīng)PCR對T<,1>代株系檢測，外源基因在TI代中的分離呈現(xiàn)多樣性，其中3個(gè)株系(Q1、Q2、E2)外源基因按照孟德爾3:1分離進(jìn)行遺傳，株行E1外源基因的遺傳不符合孟德爾分離規(guī)律。經(jīng)PenMV人工接

13、種病毒鑒定，轉(zhuǎn)基因后代表現(xiàn)不同程度的病毒抗性，為今后玉米抗病育種提供新的種質(zhì)資源。 6．農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化SCMV CI反向重復(fù)片段轉(zhuǎn)基因植株的獲得。 按照建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以E28的胚性愈傷組織為受體轉(zhuǎn)化SCMVCI反向重復(fù)片段，獲得抗性苗32株，經(jīng)PCR和PCR-Southern雜交檢測，其中5株均呈陽性。初步證明SCMV CI基因反向重復(fù)片段整合到玉米基因組中，總體轉(zhuǎn)化率為1.25％。證明本研究建立的農(nóng)