利用原生質(zhì)體技術(shù)改良多殺菌素產(chǎn)生菌.pdf

1、多殺菌素是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,兼有生物農(nóng)藥的安全性和化學(xué)合成農(nóng)藥的速效性,作用機(jī)理獨(dú)特,對哺乳動(dòng)物、昆蟲天敵和環(huán)境安全。開發(fā)該產(chǎn)品具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本文研究了刺糖多孢菌原生質(zhì)體制備與再生的條件,通過原生質(zhì)體誘變、刺糖多孢菌與阿維鏈霉菌科間原生質(zhì)體融合、刺糖多孢菌種內(nèi)原生質(zhì)體融合選育多殺菌素高產(chǎn)菌株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過考察不同

2、條件對刺糖多孢菌原生質(zhì)體制備和再生的影響,確定了菌體在添加0.3％甘氨酸的EHC培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,于R6再生培養(yǎng)基上再生,原生質(zhì)體制備率超過99％,再生數(shù)達(dá)107cfu/mL。原生質(zhì)體可置于4℃短期保存72h,長期保存需要放置于-80℃條件下。
　　 2.通過原生質(zhì)體紫外誘變獲得遺傳穩(wěn)定的多殺菌素高產(chǎn)菌株1株,多殺菌素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了近40％。
　　 3.通過雙親滅活原生

3、質(zhì)體法篩選融合子。刺糖多孢菌NU-92采用紫外滅活,滅活時(shí)間為120s,刺糖多孢菌C3-10-4采用熱滅活,滅活溫度60℃,滅活時(shí)間為50min。阿維鏈霉菌76-02-e原生質(zhì)體也采用相同溫度進(jìn)行熱滅活,滅活時(shí)間30min。
　　 4.通過電融合技術(shù)將阿維鏈霉菌與刺糖多孢菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合,考察了排列電場以及脈沖電場條什對原生質(zhì)體融合率的影響,最終確定了排列電壓7V、持續(xù)時(shí)間50s、脈沖電壓200V、脈沖時(shí)間40μs、脈沖次數(shù)2

4、次時(shí)融合率最佳,但是融合子產(chǎn)素水平不高,未篩選到遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。刺糖多孢菌種內(nèi)原生質(zhì)體融合率要顯著高于科間的原生質(zhì)體融合,但是所獲融合子產(chǎn)素水平未有提高。
　　 5.利用PEG介導(dǎo)的化學(xué)融合方法進(jìn)行刺糖多孢菌科間以及種內(nèi)的原生質(zhì)體融合。選用50％的PEG1000作為促融劑,融合時(shí)間為2-5min時(shí)融合率最高。但是阿維鏈霉菌與刺糖多孢菌科間原生質(zhì)體融合負(fù)突變率高達(dá)94.7％,未篩選到高產(chǎn)菌株。刺糖多孢菌種內(nèi)的原生質(zhì)體融合正突變