喹賽多及其主要代謝物在腸、肝和腎細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)體研究.pdf

1、做為一種喹噁啉類(lèi)化合物，喹賽多(Cyadox，Cy0)對(duì)畜禽和魚(yú)類(lèi)具有明顯的促生長(zhǎng)和抗菌作用，與同類(lèi)藥物相比毒性作用小，安全性高，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。體內(nèi)分布和代謝研究表明喹賽多及其代謝產(chǎn)物廣泛分布于腸道、肝臟和腎臟組織中。動(dòng)物體內(nèi)不同組織細(xì)胞如腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和腎細(xì)胞膜表面分布著豐富的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，如攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽)、OAT(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體)和OCT(有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體)以及外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP(多藥耐藥相

2、關(guān)蛋白)和P-gp(多藥耐藥蛋白)，其能夠主動(dòng)攝取或外排相應(yīng)的底物，從而影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征。本課題開(kāi)展喹賽多及其代謝物相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究，將有助于進(jìn)一步改善喹賽多的藥代動(dòng)力學(xué)特征和抗菌促生長(zhǎng)作用。
　　藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究方法包括細(xì)胞模型、原位/離體灌注模型和基因敲除動(dòng)物模型等，其中應(yīng)用最廣泛的是細(xì)胞模型。為了闡明Cy0及主要代謝物Cy1（脫二氧喹賽多）、Cy2(N4-脫一氧喹賽多)和Cy10(N1-脫一氧喹賽多)在腸道、肝臟和腎

3、臟中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，本課題組建立了IPEC-J2(豬空腸上皮細(xì)胞)、BRL(大鼠正常肝細(xì)胞)和PK15(豬腎上皮細(xì)胞)的攝取和雙向轉(zhuǎn)運(yùn)模型，通過(guò)分別添加OATP抑制劑利福平、OAT抑制劑丙磺舒、OCT抑制劑西咪替丁、MRP抑制劑環(huán)孢素和P-gp抑制劑維拉帕米，考察對(duì)喹賽多及其代謝物的細(xì)胞攝取量和細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響，研究闡明喹賽多及主要代謝物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中可能參與的轉(zhuǎn)運(yùn)體。
　　1、藥物對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒性作用劑量的篩選:在96孔板

4、中通過(guò)MTT方法分別考察了8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L和128μmol/L的Cy0、Cy1、Cy2及Cy10和細(xì)胞共同孵育0.5h、1h、2h和4h對(duì)IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞的生長(zhǎng)活力的影響。結(jié)果顯示作用濃度為32μmol/L，時(shí)間4h以?xún)?nèi)，Cy0、Cy1、Cy2和Cy10對(duì)IPEC-J2細(xì)胞存活率為81.02±5.62％、80.88±4.43％、83.23±2.23％、82.

5、77±3.23％;對(duì)BRL細(xì)胞存活率為81.83±2.05％、88.28±1.43％、82.82±1.68％、85.52±1.05％;對(duì)PK15細(xì)胞的存活率為83.06±3.62％、83.15±2.05％、81.71±3.56、81.37±4.78％。結(jié)果表明喹賽多及其主要代謝物在32μmol/L和作用時(shí)間4h以?xún)?nèi)，三種細(xì)胞存活率均達(dá)到80％以上，因此確定32μmol/L做為藥物對(duì)三種細(xì)胞的最大無(wú)毒性作用劑量。
　　2、細(xì)胞攝取和

6、雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立:通過(guò)對(duì)藥物的提取和色譜方法的優(yōu)化，建立了Cy0及其代謝物Cy1、Cy2和Cy10在IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞攝取和雙向轉(zhuǎn)運(yùn)模型中的提取方法及HPLC檢測(cè)方法。攝取試驗(yàn)細(xì)胞先在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，取30μL用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，剩余970μL加入1mL甲醇沉淀蛋白，在4℃條件下12000r/min離心后取上清溶液進(jìn)行氮?dú)獯蹈?，?00μL初始流動(dòng)相復(fù)溶進(jìn)HPLC檢測(cè);而對(duì)于雙向轉(zhuǎn)

7、運(yùn)樣品，加入等體積的甲醇后4℃條件下12000r/min離心，取上清溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。Cy0流動(dòng)相為乙腈∶0.5％甲酸水=13％∶87％，等度洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm;而Cy1、Cy2和Cy10流動(dòng)相為乙腈∶0.5％甲酸水=20％∶80％，等度洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm，并對(duì)方法的專(zhuān)屬性、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和線性進(jìn)行考察。結(jié)果顯示各目標(biāo)化合物與細(xì)胞雜質(zhì)及轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑能夠有效分離，各目標(biāo)化合物在20μg/L-320μg/

8、L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)在0.9962-0.9997之間，線性良好，而且攝取和雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)回收率分別在82.5％-91.0％與93.2％-97.80％之間，日間相對(duì)變異系數(shù)均≤10％。
　　3、細(xì)胞攝取試驗(yàn):首先考察了不同藥物孵育時(shí)間(5min、10min、15min和20min)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞攝取32μmol/L四種目標(biāo)化合物的影響，結(jié)果表明第10min時(shí)的細(xì)胞攝取量最大，從而確定最佳攝取時(shí)間為10min

9、;然后考察了不同藥物孵育濃度(8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L)對(duì)細(xì)胞攝取的影響，結(jié)果表明隨著添加濃度的增加，細(xì)胞攝取量呈線性增加趨勢(shì)，因此確定最大添加濃度為32μmol/L。接著在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性抑制試驗(yàn)。特異性抑制試驗(yàn)是通過(guò)向細(xì)胞中添加轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑后與對(duì)照組相比，細(xì)胞對(duì)喹賽多及其主要代謝物攝取量的變化。結(jié)果顯示在IPEC-J2細(xì)胞攝取試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，OATP抑制劑利福平減少了Cy2和Cy10的細(xì)胞攝取量，MRP抑制劑

10、環(huán)孢素增加了Cy0的細(xì)胞攝取，P-gp抑制劑維拉帕米增加了Cy0和Cy1的細(xì)胞攝取。在BRL細(xì)胞攝取試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校Ｆ酵瑯訙p少了Cy2和Cy10的細(xì)胞攝取，維拉帕米增加了Cy0和Cy1的細(xì)胞攝取。對(duì)于PK15細(xì)胞攝取試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，OAT抑制劑丙磺舒減少了Cy1的細(xì)胞攝取，環(huán)孢素增加Cy0的細(xì)胞攝取，而且維拉帕米同時(shí)增加了Cy0的Cy1的細(xì)胞攝取。統(tǒng)計(jì)分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)，而且表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，隨著抑制劑濃度的增加，這種抑制

11、作用越明顯。根據(jù)結(jié)果推測(cè)Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作為OATP的底物。
　　4、細(xì)胞單層雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn):取生長(zhǎng)良好的三種貼壁細(xì)胞制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，按照一定的密度(IPEC-J2為3.5×105/mL，BRL和PK15為2×105/mL)接種在Transwell12孔板中，放在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。使用紫外分光光度計(jì)根據(jù)不同時(shí)間測(cè)定的苯酚紅通透量，

12、計(jì)算出表觀滲透系數(shù)Papp(cm/sec)，結(jié)果顯示當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)到第6天，BRL細(xì)胞與PK15細(xì)胞培養(yǎng)到第4天時(shí)苯酚紅的表觀滲透系數(shù)均小于10-6 cm/sec，說(shuō)明細(xì)胞單層膜完整性良好，滿(mǎn)足雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)的要求。
　　然后在Transwell小室的頂側(cè)(A，Apical)和基底側(cè)(B，Basolateral)分別添加32μmol/L四種目標(biāo)化合物以及128μmol/L五種轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，分別考察轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑在不同時(shí)間(3

13、0min、60min和90min)對(duì)目標(biāo)化合物細(xì)胞單層雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。統(tǒng)計(jì)分析顯示在IPEC-J2細(xì)胞單層模型中，OATP抑制劑利福平減少Cy2和Cy10的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，在30min、60min和90min時(shí)，利福平組與對(duì)照組比較差異逐漸減小，具有時(shí)間依賴(lài)性;MRP抑制劑環(huán)孢素增加Cy0的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，在BL→AP側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性;P-gp抑制劑維拉帕米顯著增加Cy0和Cy1的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。在BRL細(xì)胞單層模型中，利福平顯著減少

14、Cy2和Cy10在AP→BL側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，維拉帕米增加Cy0和Cy1在BL→AP側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。在PK15細(xì)胞單層模型中OAT抑制劑丙磺舒減少Cy1在AP→BL側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，環(huán)孢素增加Cy0的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而維拉帕米增加了Cy0和Cy1的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作為OATP的底物。另外根據(jù)結(jié)果可以推測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體在三種細(xì)胞單層模型中