喹賽多及其主要代謝物在腸、肝和腎細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運體研究.pdf

1、做為一種喹噁啉類化合物，喹賽多(Cyadox，Cy0)對畜禽和魚類具有明顯的促生長和抗菌作用，與同類藥物相比毒性作用小，安全性高，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。體內(nèi)分布和代謝研究表明喹賽多及其代謝產(chǎn)物廣泛分布于腸道、肝臟和腎臟組織中。動物體內(nèi)不同組織細(xì)胞如腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和腎細(xì)胞膜表面分布著豐富的藥物轉(zhuǎn)運體，如攝取型轉(zhuǎn)運體OATP(有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽)、OAT(有機陰離子轉(zhuǎn)運體)和OCT(有機陽離子轉(zhuǎn)運體)以及外排型轉(zhuǎn)運體MRP(多藥耐藥相

2、關(guān)蛋白)和P-gp(多藥耐藥蛋白)，其能夠主動攝取或外排相應(yīng)的底物，從而影響藥物的藥代動力學(xué)特征。本課題開展喹賽多及其代謝物相關(guān)轉(zhuǎn)運體的研究，將有助于進一步改善喹賽多的藥代動力學(xué)特征和抗菌促生長作用。
　　藥物轉(zhuǎn)運體的研究方法包括細(xì)胞模型、原位/離體灌注模型和基因敲除動物模型等，其中應(yīng)用最廣泛的是細(xì)胞模型。為了闡明Cy0及主要代謝物Cy1（脫二氧喹賽多）、Cy2(N4-脫一氧喹賽多)和Cy10(N1-脫一氧喹賽多)在腸道、肝臟和腎

3、臟中的跨膜轉(zhuǎn)運機制，本課題組建立了IPEC-J2(豬空腸上皮細(xì)胞)、BRL(大鼠正常肝細(xì)胞)和PK15(豬腎上皮細(xì)胞)的攝取和雙向轉(zhuǎn)運模型，通過分別添加OATP抑制劑利福平、OAT抑制劑丙磺舒、OCT抑制劑西咪替丁、MRP抑制劑環(huán)孢素和P-gp抑制劑維拉帕米，考察對喹賽多及其代謝物的細(xì)胞攝取量和細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運量的影響，研究闡明喹賽多及主要代謝物跨膜轉(zhuǎn)運過程中可能參與的轉(zhuǎn)運體。
　　1、藥物對細(xì)胞的最大無毒性作用劑量的篩選:在96孔板

4、中通過MTT方法分別考察了8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L和128μmol/L的Cy0、Cy1、Cy2及Cy10和細(xì)胞共同孵育0.5h、1h、2h和4h對IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞的生長活力的影響。結(jié)果顯示作用濃度為32μmol/L，時間4h以內(nèi)，Cy0、Cy1、Cy2和Cy10對IPEC-J2細(xì)胞存活率為81.02±5.62％、80.88±4.43％、83.23±2.23％、82.

5、77±3.23％;對BRL細(xì)胞存活率為81.83±2.05％、88.28±1.43％、82.82±1.68％、85.52±1.05％;對PK15細(xì)胞的存活率為83.06±3.62％、83.15±2.05％、81.71±3.56、81.37±4.78％。結(jié)果表明喹賽多及其主要代謝物在32μmol/L和作用時間4h以內(nèi)，三種細(xì)胞存活率均達(dá)到80％以上，因此確定32μmol/L做為藥物對三種細(xì)胞的最大無毒性作用劑量。
　　2、細(xì)胞攝取和

6、雙向轉(zhuǎn)運試驗檢測方法的建立:通過對藥物的提取和色譜方法的優(yōu)化，建立了Cy0及其代謝物Cy1、Cy2和Cy10在IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞攝取和雙向轉(zhuǎn)運模型中的提取方法及HPLC檢測方法。攝取試驗細(xì)胞先在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，取30μL用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，剩余970μL加入1mL甲醇沉淀蛋白，在4℃條件下12000r/min離心后取上清溶液進行氮氣吹干，加300μL初始流動相復(fù)溶進HPLC檢測;而對于雙向轉(zhuǎn)

7、運樣品，加入等體積的甲醇后4℃條件下12000r/min離心，取上清溶液進行HPLC檢測。Cy0流動相為乙腈∶0.5％甲酸水=13％∶87％，等度洗脫，紫外檢測波長為306nm;而Cy1、Cy2和Cy10流動相為乙腈∶0.5％甲酸水=20％∶80％，等度洗脫，紫外檢測波長為275nm，并對方法的專屬性、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和線性進行考察。結(jié)果顯示各目標(biāo)化合物與細(xì)胞雜質(zhì)及轉(zhuǎn)運體抑制劑能夠有效分離，各目標(biāo)化合物在20μg/L-320μg/

8、L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)在0.9962-0.9997之間，線性良好，而且攝取和雙向轉(zhuǎn)運實驗回收率分別在82.5％-91.0％與93.2％-97.80％之間，日間相對變異系數(shù)均≤10％。
　　3、細(xì)胞攝取試驗:首先考察了不同藥物孵育時間(5min、10min、15min和20min)對IPEC-J2細(xì)胞、BRL細(xì)胞和PK15細(xì)胞攝取32μmol/L四種目標(biāo)化合物的影響，結(jié)果表明第10min時的細(xì)胞攝取量最大，從而確定最佳攝取時間為10min

9、;然后考察了不同藥物孵育濃度(8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L)對細(xì)胞攝取的影響，結(jié)果表明隨著添加濃度的增加，細(xì)胞攝取量呈線性增加趨勢，因此確定最大添加濃度為32μmol/L。接著在此基礎(chǔ)上進行特異性抑制試驗。特異性抑制試驗是通過向細(xì)胞中添加轉(zhuǎn)運體抑制劑后與對照組相比，細(xì)胞對喹賽多及其主要代謝物攝取量的變化。結(jié)果顯示在IPEC-J2細(xì)胞攝取試驗?zāi)Ｐ椭?，OATP抑制劑利福平減少了Cy2和Cy10的細(xì)胞攝取量，MRP抑制劑

10、環(huán)孢素增加了Cy0的細(xì)胞攝取，P-gp抑制劑維拉帕米增加了Cy0和Cy1的細(xì)胞攝取。在BRL細(xì)胞攝取試驗?zāi)Ｐ椭校Ｆ酵瑯訙p少了Cy2和Cy10的細(xì)胞攝取，維拉帕米增加了Cy0和Cy1的細(xì)胞攝取。對于PK15細(xì)胞攝取試驗?zāi)Ｐ?，OAT抑制劑丙磺舒減少了Cy1的細(xì)胞攝取，環(huán)孢素增加Cy0的細(xì)胞攝取，而且維拉帕米同時增加了Cy0的Cy1的細(xì)胞攝取。統(tǒng)計分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)，而且表現(xiàn)出濃度依賴性，隨著抑制劑濃度的增加，這種抑制

11、作用越明顯。根據(jù)結(jié)果推測Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作為OATP的底物。
　　4、細(xì)胞單層雙向轉(zhuǎn)運試驗:取生長良好的三種貼壁細(xì)胞制備成單個細(xì)胞懸液，按照一定的密度(IPEC-J2為3.5×105/mL，BRL和PK15為2×105/mL)接種在Transwell12孔板中，放在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。使用紫外分光光度計根據(jù)不同時間測定的苯酚紅通透量，

12、計算出表觀滲透系數(shù)Papp(cm/sec)，結(jié)果顯示當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)到第6天，BRL細(xì)胞與PK15細(xì)胞培養(yǎng)到第4天時苯酚紅的表觀滲透系數(shù)均小于10-6 cm/sec，說明細(xì)胞單層膜完整性良好，滿足雙向轉(zhuǎn)運試驗的要求。
　　然后在Transwell小室的頂側(cè)(A，Apical)和基底側(cè)(B，Basolateral)分別添加32μmol/L四種目標(biāo)化合物以及128μmol/L五種轉(zhuǎn)運體抑制劑，分別考察轉(zhuǎn)運體抑制劑在不同時間(3

13、0min、60min和90min)對目標(biāo)化合物細(xì)胞單層雙向跨膜轉(zhuǎn)運的影響。統(tǒng)計分析顯示在IPEC-J2細(xì)胞單層模型中，OATP抑制劑利福平減少Cy2和Cy10的雙向轉(zhuǎn)運，在30min、60min和90min時，利福平組與對照組比較差異逐漸減小，具有時間依賴性;MRP抑制劑環(huán)孢素增加Cy0的雙向轉(zhuǎn)運，在BL→AP側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運過程中表現(xiàn)出時間依賴性;P-gp抑制劑維拉帕米顯著增加Cy0和Cy1的雙向轉(zhuǎn)運。在BRL細(xì)胞單層模型中，利福平顯著減少

14、Cy2和Cy10在AP→BL側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運，維拉帕米增加Cy0和Cy1在BL→AP側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運，表現(xiàn)出時間依賴性。在PK15細(xì)胞單層模型中OAT抑制劑丙磺舒減少Cy1在AP→BL側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運，環(huán)孢素增加Cy0的雙向跨膜轉(zhuǎn)運，而維拉帕米增加了Cy0和Cy1的雙向跨膜轉(zhuǎn)運。結(jié)果進一步驗證了Cy0是P-gp和MRP的共同底物，Cy1是P-gp和OAT的共同底物，Cy2和Cy10共同作為OATP的底物。另外根據(jù)結(jié)果可以推測轉(zhuǎn)運體在三種細(xì)胞單層模型中