全反式維甲酸對(duì)卵巢上皮性腺癌COC2中RARa基因甲基化影響的研究.pdf

1、卵巢上皮性癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，與其他惡性腫瘤相比，由于其具有早期無明顯臨床癥狀，缺乏特異性的檢測(cè)指標(biāo)，初診時(shí)多為晚期，手術(shù)和化療難以治愈，易產(chǎn)生耐藥性及復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，致使其死亡率始終居?jì)D科惡性腫瘤首位。因此研究卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制至為重要。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性癌的發(fā)生不僅與遺傳學(xué)改變有關(guān)，也與表觀遺傳學(xué)的改變密切相關(guān)。DNA異常甲基化作為表觀遺傳學(xué)的主要方式之一，其導(dǎo)致的相關(guān)抑癌基因的表達(dá)沉默與卵巢上

2、皮性癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后存在密切的關(guān)系。由于表觀遺傳學(xué)的改變具有可逆性，通過藥物逆轉(zhuǎn)DNA異常甲基化，使抑癌基因重新表達(dá)的治療則成為目前惡性腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。但在針對(duì)卵巢惡性腫瘤的治療中，逆轉(zhuǎn)甲基化相關(guān)藥物的研究仍較少。
　　 全反式維甲酸（all-trans Retinoic Acid，ATRA）是一種經(jīng)典的細(xì)胞誘導(dǎo)分化藥物，正常情況下其通過與受體（RAR-RXR異二聚體）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)維甲酸信號(hào)傳遞系統(tǒng)，從而調(diào)

3、控靶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞DNA合成。以往我們的研究已經(jīng)從分子生物水平、生物能量方面、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞骨架等方面證實(shí)了其對(duì)卵巢上皮性腺癌的治療作用，但ATRA在逆轉(zhuǎn)DNA甲基化方面對(duì)卵巢上皮性腺癌是否也有治療作用呢？
　　 自1987年發(fā)現(xiàn)維甲酸受體以來，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與維甲酸受體的表達(dá)異常密切相關(guān)。研究較多的為RARβ，因其具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，作為一種抑癌基因，其在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)。最近有研究發(fā)

4、現(xiàn)，在乳腺癌及血液系統(tǒng)腫瘤中也存在RARα表達(dá)下降，而維甲酸介導(dǎo)的RARα激活，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，有效逆轉(zhuǎn)表達(dá)下降的趨勢(shì)，可以在腫瘤的發(fā)病及治療中發(fā)揮重要作用。
　　 前期我們研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的ATRA可以上調(diào)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中RARα基因的mRNA表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)在該研究的基礎(chǔ)上，擬從DNA甲基化方面著手，進(jìn)一歩探討ATRA作用后抑癌基因-RARα的mRNA改變可能存在的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選

5、用卵巢上皮性腺癌細(xì)胞COC2為研究對(duì)象，利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific PCR，MSP）檢測(cè)COC2細(xì)胞中是否存在RARα的異常甲基化；如存在異常甲基化，并且藥物作用后異常甲基化情況發(fā)生改變，再利用基因測(cè)序及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）進(jìn)一步檢測(cè)各組中RARα基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化位點(diǎn)的數(shù)量及其mRNA的表達(dá)情況，了解其mRNA表達(dá)改變與甲基化位點(diǎn)數(shù)是否存在相關(guān)性；同時(shí)檢測(cè)各組中DNA異常

6、甲基化過程中的關(guān)鍵酶—DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b）的mRNA表達(dá)，以探討ATRA是否通過影響DNMT3b的表達(dá)使甲基化位點(diǎn)數(shù)發(fā)生改變。
　　
　　 第一部分：全反式維甲酸對(duì)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中RARα基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化位點(diǎn)及其mRNA的影響
　　 目的：觀察卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中是否存在RARα基因的異常甲基化；如存在異常甲基化

7、情況，不同濃度及作用時(shí)間的ATRA干預(yù)后，COC2中RARα基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)的改變，以及RARα基因mRNA表達(dá)的情況。探討ATRA對(duì)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中RARα基因的去甲基化作用，ATRA作用后其mRNA表達(dá)改變與啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變可能存在的聯(lián)系。
　　 方法：將卵巢上皮性腺癌細(xì)胞COC2培養(yǎng)至105個(gè)/ml濃度時(shí)加藥干預(yù)，將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為陰性對(duì)照組及ATRA干預(yù)組，干預(yù)組再分為3小組，分別給予1、5、

8、r>　　 10μmol/L的ATRA，置于相同條件下培養(yǎng)，每小組分為三瓶，分別維持藥物濃度干預(yù)3d、6d、9d。提取各組細(xì)胞的基因組DNA，用MSP、基因測(cè)序的方法檢測(cè)用藥前后COC2細(xì)胞中RARα基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)的情況。提取各組細(xì)胞中的總RNA，用RT-PCR法檢測(cè)各組RARα基因mRNA表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：COC2細(xì)胞中存在RARα基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化；不同濃度及作用時(shí)間的ATRA處理后，測(cè)序結(jié)果顯示RAR

9、α基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化位點(diǎn)數(shù)目出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)出濃度及時(shí)間依賴性。1、5μmol/L ATRA處理3d、6d、9d，及10μmol/L處理3d、6d后，均只有RARα基因啟動(dòng)子的甲基化條帶，未出現(xiàn)非甲基化條帶，而測(cè)序結(jié)果表明甲基化位點(diǎn)數(shù)隨時(shí)間的增加有所減少。10μmol/L處理9d后出現(xiàn)微弱非甲基化條帶。各ATRA處理組的RARα mRNA的表達(dá)與陰性對(duì)照組相比均升高，且具有時(shí)間、濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)10μmol/

10、L處理9d后有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。雖然干預(yù)后，RARα基因mRNA表達(dá)增加和ATRA逆轉(zhuǎn)甲基化作用增強(qiáng)總的趨勢(shì)一致，但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并未顯示兩種改變數(shù)量上的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：COC2細(xì)胞中存在RARα基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化；ATRA可以部分逆轉(zhuǎn)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中RARα啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化位點(diǎn)，同時(shí)增加RARα的mRNA表達(dá)。
　　
　　 第二部分：全反式維甲酸對(duì)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株

11、COC2中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b的mRNA表達(dá)的影響
　　
　　 目的：通過檢測(cè)ATRA對(duì)卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中DNA甲基化的關(guān)鍵酶—DNMT3b的mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討ATRA影響DNA甲基化可能的作用機(jī)制。
　　 方法：細(xì)胞分組及ATRA的處理方法同第一部分，提取各組細(xì)胞的總RNA，RT-PCR法檢測(cè)各組中DNMT3b的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：各處理組與陰性對(duì)照組相比DN

12、MT3b mRNA的表達(dá)均有下降，且具有時(shí)間及濃度依賴性。處理9d后，10μmol/L ATRA處理組DNMT3b 的陽性條帶灰度值與β-action的比值為（2.243±0.175）與陰性對(duì)照組（3.929±0.159）、1μmol/L組（2.787±0.086）、5μmol/L組（2.557±0.215）比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：經(jīng)ATRA處理后，卵巢上皮性腺癌細(xì)胞株COC2中DNMT3b的mRNA