JNKs分子在小鼠著床前胚胎中表達、激活及其與細胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、第一部分：JNKs蛋白在各階段植入前小鼠胚胎中的表達 目的：了解JNKs蛋白在各階段小鼠著床前胚胎中的表達規(guī)律： 方法：實驗動物為昆明種小鼠，經(jīng)過藥物促排卵后，分別獲取妊娠0.5天(合子)，1.5天(二細胞期)，2.5天(融合期桑椹胚)，3.5天(早期囊胚)的胚胎；使用JNK多克隆抗體，通過免疫熒光法結(jié)合激光共聚焦技術(shù)，在蛋白水平上定性且半定量檢測個階段鼠胚內(nèi)JNKs蛋白的表達，并且初步找出其中規(guī)律結(jié)果與結(jié)論：

2、1.在各階段的小鼠胚胎細胞的胞漿內(nèi)均有JNKs蛋白的表達； 2.隨著胚胎的發(fā)育，JNKs蛋白表達呈上升趨勢，其中在妊娠1.5天(2細胞階段)到妊娠2.5天(融合期桑椹胚階段)上升最為明顯(熒光強度3176.9±446vs1297.2±392.3，P＜0.05)； 第二部分外界培養(yǎng)環(huán)境與小鼠早期胚胎細胞內(nèi)JNKs分子的激活 目的：探討體外培養(yǎng)環(huán)境及其內(nèi)各種刺激因素對小鼠胚胎細胞內(nèi)JNKs分子激活的影響 方法

3、： 1.分別獲取體內(nèi)及體外的妊娠第3.5天的小鼠胚胎(早期囊胚階段)，以免疫熒光和Western-Blotting的檢測方法，比較兩者細胞內(nèi)JNKs分子的激活(磷酸化)水平； 2.以免疫熒光法比較不同溫度下(35攝氏度，37攝氏度，39攝氏度)培養(yǎng)9小時后小鼠著床前胚胎(早期囊胚期)細胞內(nèi)JNKs分子的激活水平。 3.以免疫熒光法比較在3種不同培養(yǎng)液(CZB,G-1,G-2)中培養(yǎng)48小時后的小鼠胚胎細胞內(nèi)JNK

4、s分子的激活水平； 4.以免疫熒光法比較在不同培養(yǎng)密度下(＜3個/25ul；15-25個/25ul與＞50個/ul)培養(yǎng)48小時后小鼠胚胎細胞內(nèi)JNKs分子的激活水平。 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)的小鼠胚胎細胞內(nèi)JNKs分子的激活水平顯著高于體內(nèi)發(fā)育者。(免疫熒光法與Western-Bloting法比較均有統(tǒng)計學意義) 2.而在39攝氏度培養(yǎng)下9小時后的鼠胚細胞內(nèi)JNKs分子的激活水平明顯高于35與37攝氏度組

5、(P＜0.05)； 3.而使用CZB培養(yǎng)液培養(yǎng)的胚胎細胞內(nèi)激活的JNKs分子的熒光密度顯著高于G-2培養(yǎng)液組(P＜0.05) 4.而在25微升的液滴中，當培養(yǎng)密度)50個胚胎/液滴時，細胞內(nèi)激活的JNKs分子的含量顯著增加，較另外兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) 結(jié)論： 1.體外培養(yǎng)的小鼠胚胎細胞內(nèi)JNKs分子的激活水平高于體內(nèi)發(fā)育者； 2.培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)液的成分以及培養(yǎng)密度的變化局可以影響小

6、鼠胚胎細胞內(nèi)JNKs分子的激活。 第三部分：JNKs分子的激活與小鼠早期胚胎的發(fā)育與凋亡 目的：探討JNKs分子的激活與小鼠胚胎細胞凋亡之間的關(guān)系： 方法： 1.比較在培養(yǎng)液內(nèi)加入不同濃度(10uM,20uM與50uM)或在不同時間內(nèi)(妊娠1.5天到2.5天與妊娠2.5天到妊娠3.5天)加入JNKs激活的特異性抑制劑SP600125對小鼠胚胎囊胚形成率的影響； 2.取妊娠3.5天的小鼠早期囊胚，以

7、TUNEL標記法比較培養(yǎng)液加入或不加入SP600125的情況下，熱處理(41攝氏度)6小時后小鼠囊胚細胞的凋亡比例； 3.取妊娠1.5天的小鼠胚胎，以線粒體膜電位熒光探針JC-1染色法，比較加入或不加入SP600125的情況下，熱處理(41攝氏度)1小時后胚胎細胞內(nèi)線粒體膜電位的改變； 4.同上法，比較加入或不加入SP600125的情況下，熱處理3小時后小鼠胚胎細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達水平的差異； 結(jié)果：

8、 1.培養(yǎng)液中添加不同濃度SP600125后，囊胚形成率有所上升，其中當SP600125濃度為20uM是囊胚形成率最高，達72.3％，培養(yǎng)液中在妊娠1.5-2.5天時(卵裂球融合前)添加SP600125比妊娠2.5-3.5天時(卵裂球融合后)添加SP600125的囊胚形成率更高，但以上差異均未見統(tǒng)計學意義； 2.在培養(yǎng)液中加入20uM濃度的SP600125時，可顯著降低熱處理后小鼠囊胚中調(diào)亡的細胞比例(39.27±7.1

9、5Vs64.97±8.23，P＜0.05)； 3.在培養(yǎng)液中加入20uM濃度的SP600125時，熱處理1小時后胚胎膜電位喪失的線粒體比例顯著下降(P＜0.05) 4.在培養(yǎng)液中加入20uM濃度的SP600125時，熱處理后3小時的胚胎細胞內(nèi)Caspase蛋白表達的水平明顯下降(P＜0.05) 結(jié)論： 1.JNKs分子的激活可能影響小鼠胚胎進一步的發(fā)育潛力； 2.外界刺激引起的JNKs分子的激活可